異常細(xì)胞間通訊在白血病中作用機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞通訊是維持細(xì)胞生存和功能的基礎(chǔ),其異常與疾病密切相關(guān),在經(jīng)典單向信號傳遞機(jī)制的的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)并初步闡明了反向信號傳遞現(xiàn)象,其研究成為生命科學(xué)研究熱點(diǎn)之一。mM-CSF是巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的一種選擇性剪接產(chǎn)物,為膜結(jié)合型細(xì)胞因子,我們前期的研究證實(shí)了它具有并置性和粘附分子樣作用,與其受體結(jié)合后可能傳遞雙向信號。本論文在我室多年研究的基礎(chǔ)上,對mM-CSF介導(dǎo)的反向信號及其傳遞機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 構(gòu)建了野生型

2、和突變型mM-CSF的pTARGET真核表達(dá)載體以及MSCV-PGK-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,經(jīng)DNA測序證實(shí)后分別轉(zhuǎn)染、感染Namalwa細(xì)胞,篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株:用MSCV-PGK-GFP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得陽性表達(dá)細(xì)胞。采用RT-PCR和Western blot方法證實(shí)上述細(xì)胞構(gòu)建成功。
　　 以穩(wěn)定表達(dá)野生型mM-CSF的Namalwa細(xì)胞株以及瞬時(shí)表達(dá)mM-CSF的HEK293細(xì)胞為模型,研究mM-CSF介導(dǎo)

3、的反向信號傳遞?？扇苄允荏w作用后可引起胞內(nèi)分子量約為40kD的蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著升高；蛋白芯片結(jié)果顯示多種蛋白激酶磷酸化水平發(fā)生變化；Western blot方法進(jìn)一步證實(shí)ERK、Akt在可溶性受體作用后磷酸化水平升高,提示mM-CSF可以介導(dǎo)反向信號,并且ERK、Akt信號途徑參與該反向信號傳遞。
　　 以穩(wěn)定表達(dá)截短突變型(胞內(nèi)截短30個(gè)氨基酸殘基)以及胞內(nèi)三點(diǎn)突變型(Ser226、Ser235和Thr246均突變?yōu)锳

4、la)mM-CSF的Namalwa細(xì)胞株以及瞬時(shí)表達(dá)二者的HEK293細(xì)胞為模型,用同樣的方法研究mM-CSF胞內(nèi)區(qū)在反向信號傳遞中的作用。可溶性受體作用后無上述蛋白激酶磷酸化水平的改變,提示mM-CSF胞內(nèi)區(qū),特別是胞內(nèi)區(qū)的Ser226、Ser235和Thr246在反向信號傳遞中起關(guān)鍵作用。
　　 為進(jìn)一步探討mM-CSF介導(dǎo)反向信號的傳遞機(jī)制,以穩(wěn)定表達(dá)胞內(nèi)區(qū)單點(diǎn)突變型(Ser226突變?yōu)锳la)和雙點(diǎn)突變型(Ser235和

5、Thr246均突變?yōu)锳la)mM-CSF的Namalwa細(xì)胞株為模型,研究胞內(nèi)區(qū)三位點(diǎn)各自在反向信號傳遞中的作用異同。初步結(jié)果顯示,Ser226在反向信號傳遞中起重要作用。
　　 綜上所述,本文深入研究了mM-CSF介導(dǎo)的反向信號及其傳遞機(jī)制,證實(shí)了mM-CSF可以介導(dǎo)反向信號。首次證明了ERK、Akt信號途徑參與該反向信號傳遞；mM-CSF的胞內(nèi)區(qū)特別是Ser226、Ser235和Thr246在介導(dǎo)反向信號傳遞中其關(guān)鍵作用,且