NeuropiliN-1及其配體在白血病中免疫調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]
　　通過分析Neuropilin-1（NRP-1）及其配體Semaphorins-3A(Sema3A)、Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)165在白血病患者中的表達(dá)趨勢及NRP-1mRNA表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性，并通過體外實(shí)驗(yàn)研究Sema3A、VEGF165對白血病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)上NRP-1及對白血病細(xì)胞增殖的影響，探討NRP-1及其相關(guān)配體在白血病發(fā)病中免疫

2、調(diào)節(jié)機(jī)制及其所起的作用，為尋找白血病的免疫治療靶標(biāo)提供新的思路。
　　[方法]
　　1.研究對象
　　選取2014年4月～2015年4月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科34例初治白血病患者作為研究對象，其中男性18例，女性16例，男女比例為1.1∶1，年齡14～83歲，中位年齡為47歲。根據(jù)張之南主編的第二版《血液病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為急性髓細(xì)胞性白血病(AML)13例、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)10例，慢性淋巴細(xì)胞白血

3、病(CLL)11例。AML疾病組除外M3患者，所收集病例中M2患者4例，M4患者7例，M5患者2例;ALL疾病組患者均為L2型，健康志愿者32例，年齡23～65歲，中位平均年齡36歲，男女比例為1∶1.1。本課題研究已獲廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，所有入組人員均告知實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，簽署知情同意書?br>　　2.研究方法
　　2.1應(yīng)用SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)定量PCR技術(shù)檢測34例初治白血病患者及32例健康對照者NRP-1及Sem

4、a3A、VEGF165 mRNA的表達(dá)。結(jié)果采用2-ΔCt法進(jìn)行計(jì)算。比較分析NRP-1及其相關(guān)配體Sema3A、VEGF165 mRNA在白血病及健康人中的表達(dá)趨勢，并分析NRP-1 mRNA表達(dá)與臨床特征及預(yù)后關(guān)系。
　　2.2利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Sema3A及VEGF165處理后白血病患者Tregs上NRP-1的表達(dá);并利用SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)定量PCR技術(shù)檢測白血病細(xì)胞經(jīng)過Sema3A及VEGF165處理后NRP-1

5、mRNA的表達(dá)變化。
　　2.3應(yīng)用CFSE標(biāo)記白血病細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)過Sema3A及VEGF165處理后，白血病細(xì)胞的增殖情況。進(jìn)一步探討NRP-1及其配體在白血病發(fā)病中所起的作用。
　　[結(jié)果]
　　1.34例初治白血病患者中31例檢測到NRP-1 mRNA表達(dá)，陽性率為91.17％，陽性者中位表達(dá)水平為84.42(0.01～1104.85)×10-5，而32例健康對照組中，26例檢測到NRP-1表達(dá)，陽性率

6、為78.79％，陽性者中位表達(dá)水平為14.02(2.39～29.19)×10-5。NRP-1 mRNA表達(dá)水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.419，P＜0.05)。
　　2.34例初治白血病患者中24例檢測到Sema3A mRNA表達(dá)，陽性率為70.59％，陽性者中位表達(dá)水平為13.94(0.38～458.12)×10-5，而32例健康對照組中，27例測到Sema3A mRNA表達(dá)，陽性率為84.38％，陽性者中位表

7、達(dá)水平為30.90(4.79～158.64)×10-5。白血病患者Sema3A mRNA表達(dá)與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.246，P＞0.05）。
　　3.34例初治白血病患者中31例檢測到VEGF165 mRNA表達(dá)，陽性率為91.18％，陽性者表達(dá)水平為1269.14(18.50～23325.83)×10-5，而32例健康對照組中，31例檢測到VEGF165 mRNA表達(dá)，陽性率96.88％。陽性者中位表達(dá)水平

8、為3794.72(293.99～10732.07)×10-5。白血病患者VEGF165 mRNA表達(dá)低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.196，P＜0.05）。
　　4.NRP-1 mRNA表達(dá)與患者年齡以及初診時(shí)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平無明顯相關(guān)性;與初診時(shí)患者乳酸脫氫酶(LDH)水平(r=-0.367，P=0.045)、骨髓幼稚細(xì)胞比例(r=0.658，p=0.001)、化療第一療程后未

9、達(dá)到完全緩解（r=0.540，P=0.011）、髓外浸潤(r=0.395，P=0.038)呈相關(guān)關(guān)系。
　　5.利用Sema3A、VEGF165處理初治白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞24小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測Tregs及Tregs上NRP-1的表達(dá)，對比經(jīng)Sema3A、VEGF165處理后NRP-1表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示經(jīng)過Sema3A處理后Tregs及Treg上NRP-1表達(dá)與未加Sema3A、VEGF165的對照組相比均降低（6

10、.41±3.10 vs7.48±3.78）、（1.92±1.96 vs3.49±3.29），(P＜0.05);而經(jīng)過VEGF165處理后，Tregs及Treg上NRP-1表達(dá)與未加Sema3A、VEGF165的對照組相比未見明顯變化(P＞0.05)。
　　6.CFSE法檢測經(jīng)Sema3A、VEGF165處理后白血病細(xì)胞的增殖情況，以相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)未加處理因素的細(xì)胞作為對照。經(jīng)過處理后細(xì)胞增殖水平與未處理組比較無明顯差異(P＞0.05)

11、。
　　[結(jié)論]
　　1.白血病患者中NRP-1 mRNA表達(dá)水平高于正常對照組，而其配體VEGF165表達(dá)與健康對照組相比，表達(dá)較低。
　　2.NRP-1基因與白血病發(fā)病的臨床特征相關(guān)，有望成為白血病危險(xiǎn)度分層和預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。
　　3.在白血病患者中，激活Sema3A通路，可使NRP-1表達(dá)水平降低。NRP-1的Sema3A、VEGF165配體通路參與白血病發(fā)病，激活Sema3A通路可能在白血病發(fā)病中發(fā)揮