急性髓細(xì)胞白血病中Jab1-CSN5表達(dá)異常及相關(guān)作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、白血病作為一種惡性侵襲性疾病，嚴(yán)重危害人類健康，有關(guān)其病因機(jī)制和干預(yù)治療手段的研究一直都是醫(yī)學(xué)科技發(fā)展的重要方向之一。急性髓細(xì)胞白血病(Acute myeloidleukemia，AML)是一種造血干細(xì)胞惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為骨髓原始細(xì)胞不可調(diào)控的增殖和成熟障礙，使分化受阻，進(jìn)而導(dǎo)致這些干/祖細(xì)胞在血液和其它器官中過度積累[1,2]，并侵犯肝、脾、淋巴結(jié)，最終侵犯全身組織、器官，抑制正常造血功能[3]。AML具有發(fā)病率高（白血病中較高，2

2、8％）、長期存活率偏低(白血病中較低，五年無病生存率30％)、缺乏有效治療方式等特點，不僅給患者和家庭造成極大的痛苦，同時也已成為日益嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會問題。
　　Jab1/CSN5/（c-Jun activation domain-binding protein-1）最初是作為c-jun轉(zhuǎn)錄共激活因子被發(fā)現(xiàn)，后發(fā)現(xiàn)是CSN（COP9信號復(fù)合體）組分之一，在人、小鼠、酵母、植物中均高度保守[4]。Jab1/CSN5通過改變靶蛋白

3、胞內(nèi)定位和促進(jìn)靶蛋白降解等方式負(fù)調(diào)控某些抑癌基因（如p27、p53、HIF-1、Rad51等）[5-8]，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和DNA損傷修復(fù)[6，9]，在多種實體腫瘤中高表達(dá)并與惡性程度密切相關(guān)[3，10-14]。本實驗室在2013年研究報道，Jab1/CSN5蛋白能與Smurf蛋白結(jié)合構(gòu)成HECT型E3泛素連接酶參與到Smad7蛋白的泛素化降解過程，Jab1/CSN5增加會造成Smad7降解加速，導(dǎo)致細(xì)胞分化異常[15]。
　　本

4、課題立足于AML病因機(jī)制的基礎(chǔ)科學(xué)問題，以Jab1/CSN5與多種腫瘤密切相關(guān)及其在細(xì)胞分化過程發(fā)揮生物學(xué)功能為切入點[15]，利用AML患者骨髓樣本檢測Jab1/CSN5表達(dá)水平，進(jìn)而在AML細(xì)胞系中研究Jab1/CSN5異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化的變化趨勢，并針對此特征，初步嘗試探索光譜調(diào)制靶向調(diào)節(jié)Jab1/CSN5水平，為進(jìn)一步解釋AML發(fā)生發(fā)展機(jī)制和探索有關(guān)誘導(dǎo)分化靶向策略提供一定的科學(xué)線索和實驗依據(jù)。
　　[研究目的]

5、r>　　針對Jab1/CSN5與多種腫瘤密切相關(guān)及其在細(xì)胞分化過程發(fā)揮生物學(xué)功能的特征，本課題主要針對Jab1/C SN5在急性髓細(xì)胞白血病中表達(dá)變化趨勢及相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　[研究方法]
　　1)免疫組化實驗:收集數(shù)例AML患者骨髓樣本和對照組（緩解期的AML患者）骨髓樣本，涂片后利用DAB試劑盒檢測Jab1/CSN5表達(dá)差異。
　　2)粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的獲取:收集5 mL AML患者骨髓，加人淋巴細(xì)胞分

6、離液，離心后樣品由上至下分為四層。其中第二層為單個核細(xì)胞層，含有淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2 h后單核細(xì)胞貼壁生長，懸浮細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞;沉淀層中含有紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液處理后分離獲得粒細(xì)胞。
　　3)Western-blotting:利用分離獲取的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，收集蛋白后，檢測Jab1/CSN5表達(dá)情況。
　　4)病毒感染實驗:分別用Jab1高表達(dá)病毒和Jab1 shRNA病毒感染H

7、L60、K562和U937細(xì)胞，建立穩(wěn)篩的細(xì)胞系。
　　5)K562細(xì)胞和U937細(xì)胞分化實驗:在六孔板中接種2.0×105個K562和U937細(xì)胞，用10 ng/mL PMA處理。收集細(xì)胞，按照比例加入流式抗體，置于37℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30min，F(xiàn)ACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分化指標(biāo)CD11b、CD14和CD15的表達(dá)及利用BrdU摻入實驗檢測其增殖情況。
　　6)瑞氏染色:收集高表達(dá)Jab1的K5

8、62和U937細(xì)胞，涂片后用瑞氏染色法檢測細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　[實驗結(jié)果]
　　1)對骨髓樣本免疫組化條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　2)基于優(yōu)化的免疫組化條件，分別對AML發(fā)病期及緩解期患者的骨髓樣本進(jìn)行染色，分析比較后發(fā)現(xiàn)Jab1/CSN5在AML發(fā)病期患者骨髓樣本中表達(dá)異常增高。
　　3)利用AML患者骨髓樣本分離的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，Western-blotting實驗結(jié)果表明Jab1/CSN5在粒細(xì)胞中表達(dá)顯著高于

9、淋巴細(xì)胞。
　　4)由于骨髓樣本數(shù)量有限，接下來我們在白血病細(xì)胞系K562、U937和HL60中研究Jab1/CSN5對增殖分化的作用。慢病毒包裝Jab1/CSN5表達(dá)載體有效感染K562和U937后，BrdU流式檢測結(jié)果顯示細(xì)胞增殖顯著增加，而分化指標(biāo)CD11b、CD14和CD15表達(dá)降低。
　　5)在白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞中，慢病毒包裝Jab1 shRNA載體有效干擾Jab1表達(dá)后，BrdU流式檢測結(jié)果增殖顯著降低，分

10、化指標(biāo)CD14表達(dá)增加，而CD11b、CD13、CD15表達(dá)變化不顯著。
　　6)瑞氏染色方法檢測高表達(dá)Jab1后K562和U937的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示原始多核細(xì)胞比例增加。
　　7)利用實驗室已經(jīng)建立的藍(lán)光LED光學(xué)操控平臺，發(fā)現(xiàn)特定參數(shù)的藍(lán)光（波長455nm，光強(qiáng)100μW/cm2，時間60 min）照射K562和U937細(xì)胞后，Jab1/CSN5表達(dá)顯著下降。
　　[結(jié)論]
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)，Jab1/C