髓系白血病異常NHEJ DNA修復(fù)功能的研究.pdf

1、目的：設(shè)計(jì)并建立一個(gè)用于臨床標(biāo)本的體外NHEJ檢測體系，以正常骨髓或外周血作對照，研究髓系白血病細(xì)胞非同源末端連接修復(fù)DNA雙鏈斷裂的能力和DNA斷端連接的精確性。研究髓系白血病過度活躍的修復(fù)能力是否依賴NHEJ相關(guān)的主要蛋白質(zhì)功能，以及髓系白血病細(xì)胞Ku蛋白和DNA依賴蛋白激酶的表達(dá)水平和基因表達(dá)情況?！　》椒ǎ赫９撬杌蛲庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞、白血病細(xì)胞提取的核蛋白與線性的pUC18質(zhì)粒DNA在體外一定的條件下一起進(jìn)行連接反應(yīng)。結(jié)束后質(zhì)

2、粒DNA經(jīng)凝膠分離，用SYBRgreenⅠ染色成像。每個(gè)標(biāo)本的DNA末端連接能力以所連接的DNA片段的輝度除以所有DNA片段的輝度的百分比表示。以上述方法對7種髓系白血病細(xì)胞株、淋巴系白血病細(xì)胞株Jurkat、骨髓瘤細(xì)胞株U266、5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、16例正常骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞、20例慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞和19例初診的急性髓系白血病細(xì)胞進(jìn)行檢測。正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞，初診的慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，與K562進(jìn)行Co60輻照6Gy，培養(yǎng)1

3、2～16小時(shí)，進(jìn)行連接實(shí)驗(yàn)，同時(shí)取照射后即時(shí)收集的細(xì)胞和自身對照作對比。慢粒白血病細(xì)胞用10μmol/L三氧化二砷作用24小時(shí)后檢測DNA連接能力。感受態(tài)大腸桿菌DH5α與正常骨髓和白血病細(xì)胞連接的質(zhì)粒DNA一起電擊轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)于含X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基瓊脂板表面，質(zhì)粒完整修復(fù)的菌落呈藍(lán)色。若修復(fù)不準(zhǔn)確菌落呈白色。錯(cuò)誤修復(fù)率用白斑占所有形成的菌落克隆的百分比表示。設(shè)計(jì)圍繞EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物，對所有白斑和部分藍(lán)斑進(jìn)行PCR分