肺癌相關(guān)新候選原癌基因OLC1的功能及應(yīng)用研究.pdf

1、目的：(1)運(yùn)用生物信息學(xué)手段獲取OLCl基因相關(guān)信息：(2)運(yùn)用有限稀釋法篩選得到穩(wěn)定過表達(dá)OLC1的H1299(大細(xì)胞肺癌)細(xì)胞株。為深入研究OLC1在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變中的作用，對H1299-OLC1細(xì)胞株實(shí)施生長速度的測定實(shí)驗(yàn)，平板集落形成實(shí)驗(yàn)，不同時(shí)段細(xì)胞周期檢測等系列實(shí)驗(yàn)，即進(jìn)行將OLC1作為候選原癌基因的功能研究；(3)以H1299-OLC1為細(xì)胞模型，OLC1作為候選藥物靶標(biāo)，篩選1180種藥物小分子化合物，初步建立小分子

2、化合物的藥物篩選平臺。(4)以O(shè)LC1為藥物靶標(biāo)，研究4種抗癌藥物和新疆阿魏菇提取物對肺癌細(xì)胞的影響。 方法：(1)通過生物信息學(xué)方法，利用在線數(shù)據(jù)庫和分析軟件分析、預(yù)測OLC1基因的染色體定位、編碼氨基酸序列、結(jié)構(gòu)域、同源序列等信息；(2)OLC1穩(wěn)定株的篩選、鑒定及功能研究：應(yīng)用有限稀釋法篩選H1299-OLC1穩(wěn)定株；Westem Blotting檢測OLC1蛋白的表達(dá)；新候選原癌基因OLC1的功能研究：MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

3、檢測H1299-OLC1細(xì)胞、空載體細(xì)胞H1299-pcDB、親本細(xì)胞H1299的生長情況：平板集落形成實(shí)驗(yàn)測定H1299-OLC1與對照H1299-pcDB的細(xì)胞獨(dú)立生長情況及形成集落數(shù)目；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察處于對數(shù)生長期H1299-OLC1、H1299-pcDB細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)細(xì)胞周期變化情況。(3)以O(shè)LC1為靶標(biāo)的1180種候選藥物小分子化合物的篩選：采用鈣黃綠素為熒光探針，應(yīng)用熒光比色法，熒光記數(shù)儀G

4、ENios Pro reader(Tecan)檢測。綠色熒光強(qiáng)度值在535nm處檢測，激發(fā)波長484nm。通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化：(4)OLC1為靶標(biāo)的藥敏試驗(yàn)：MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測4種抗癌藥物和新疆阿魏菇粗提物對H1299-OLC1細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果：(1)通過生物信息學(xué)分析，確定OLC1基因定位于16q22.3，CDS區(qū)編碼364個氨基酸，無跨膜區(qū)，無明顯信號肽序列。亞細(xì)胞定位為，細(xì)胞核：56.5％，細(xì)胞

5、質(zhì)：30.4％，線粒體：13.0％。有兩個保守結(jié)構(gòu)域分別為DUF292區(qū)(位于33-139氨基酸)和脯氨酸富集區(qū)(位于220-278氨基酸)。在許多類型的腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中都有分布；(2)穩(wěn)定表達(dá)OLCl的H1299單克隆細(xì)胞株均表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性；MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示H1299-OLC1細(xì)胞株生長速度明顯快于對照空載體細(xì)胞H1299-pcDB(P<0.05)；平板集落形成克隆數(shù)明顯多于空載體穩(wěn)定株(P<0.05)：細(xì)胞周期檢測顯

6、示H1299-OLC1細(xì)胞周期變化中G1期細(xì)胞所占比例顯著高于空載體細(xì)胞，而且在24小時(shí)到72小時(shí)時(shí)，增幅大大高于空載體細(xì)胞株(P<0.05)；(3)建立以鈣黃綠素為熒光探針的小分子化合物篩選平臺，初篩獲取6種候選藥物；(4)H1299-OLC1穩(wěn)定株有較強(qiáng)的抗藥性；(5)新疆阿魏菇提取物能有效抑制H1299-OLCC1穩(wěn)定株的增殖。 結(jié)論：(1)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)OLC1在多種組織和腫瘤細(xì)胞中分布，具有特殊保守域結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)

7、，提示其可能具有重要功能；(2)利用有限稀釋法進(jìn)行單克隆穩(wěn)定株的篩選，得到穩(wěn)定過表達(dá)OLC1的H1299單克隆細(xì)胞株模型；(3)體外系列試驗(yàn)證明OLC1能使H1299細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，提示OLC1具有原癌基因的屬性。(4)建立以鈣黃綠素為熒光探針，熒光記數(shù)儀與顯微鏡熒光和明場檢測相結(jié)合的，候選藥物小分子化合物針對特定基因作為藥物靶標(biāo)篩選平臺；(5)初步篩選發(fā)現(xiàn)6種候選藥物小分子化合物；(6)OLC1過表達(dá)穩(wěn)定株的耐藥性高于對照空載