新的候選抑癌基因DENND2D的鑒定與功能研究.pdf

1、目前，肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴重威脅人類健康。我們實驗室利用以往構(gòu)建的肺癌差異表達基因EST文庫提供的信息，克隆了51個肺癌相關新基因。本研究的目的是鑒定新的肺癌相關抑癌基因，為肺癌提供新的早期診斷分子標志物和治療標靶，并為肺癌分子機理的研究提供新的基礎內(nèi)容。 本研究將候選基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞，體外評估這些基因?qū)毎麗盒赞D(zhuǎn)化的促進或抑制作用；利用RT-PCR的方法檢測目的基因在肺癌組織及其對照組織、肺癌細胞系和

2、永生化支氣管上皮細胞系、以及原代培養(yǎng)的正常支氣管上皮細胞中的表達情況；通過MTT法、細胞集落形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗，分析目的基因?qū)Ψ伟┘毎礜CI-H1299增殖能力及非錨定性生長能力的影響：通過裸鼠皮下成瘤實驗觀察目的基因?qū)Ψ伟┘毎礜CI-H1299致瘤能力的影響；采用流式細胞術檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因后對細胞周期和凋亡的影響；通過劃痕愈合實驗了解目的基因?qū)毎w移性的影響；通過寡核苷酸微陣列技術檢測目的基因?qū)毎虮磉_譜的影響

3、。 本研究從本實驗室前期工作克隆的5個肺癌相關新基因之中，通過表型篩選得到一個能明顯抑制NIH/3T3細胞形成轉(zhuǎn)化集落的候選抑癌基因DENND2D。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在27例肺鱗癌及其配對正常肺組織中，48．1％的腫瘤組織中DENND2D的表達水平下降甚至完全缺失：在9株肺癌細胞系和作為癌前病變模型的2株永生化的支氣管上皮細胞系中大部分表達缺失；但是在15例原代培養(yǎng)的正常支氣管上皮細胞中，此基因均有一定程度的表達。體外實驗顯

4、示，DENND2D基因穩(wěn)定過表達能明顯抑制NCI-H1299細胞的增殖速度，降低其平板集落形成數(shù)目，并減少軟瓊脂中集落形成的數(shù)目。體內(nèi)實驗證實，DENND2D基因穩(wěn)定過表達能顯著減弱NCI-H1299細胞在裸鼠皮下的成瘤能力，降低裸鼠成瘤率及所形成腫瘤的體積。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，DENND2D基因主要是通過Gl/S期阻滯來發(fā)揮其抑制生長的作用，而不是通過對凋亡的誘導。經(jīng)RT-PCR檢測顯示，DENND2D基因穩(wěn)定過表達的細胞中細胞周期調(diào)

5、控因子p15、p16、p27、p21等基因均有不同程度的表達下調(diào)。劃痕愈合實驗初步提示DENND2D基因能抑制H1299細胞的遷移能力，使劃痕愈合時間延長?；蛐酒Y(jié)果提示DENND2D外源性過表達可對細胞周期，MAPK信號通路、細胞間及細胞與基質(zhì)間黏附等重要的通路中的某些信號分子的表達產(chǎn)生影響，可在多方面對腫瘤的進展產(chǎn)生作用。綜上所述，肺癌相關新基因DENND2D具有抑癌基因的特性，提示它是一個候選的抑癌基因。在癌前病變模型中已見DE