神經(jīng)細胞來源Microparticles在顱腦創(chuàng)傷相關凝血功能障礙發(fā)生中的機制研究.pdf

1、目的:目前國際上尚缺乏顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)相關凝血功能障礙明確的發(fā)生機制及有效的治療方法。本實驗將通過建立中型TBI小鼠模型，觀察循環(huán)血中神經(jīng)細胞來源microparticles(brain-derived microparticles，BDMP)含量及凝血功能變化，結合體外制備BDMP的方法，體外研究BDMP的促凝作用，與血小板的相互作用及Lactadherin蛋白對BDMP的清除作用。試圖

2、闡明TBI相關凝血功能障礙的物質基礎，明確TBI相關凝血功能障礙的發(fā)生機制，探討建立預防治療TBI引起的凝血功能障礙的新方法，成為研究TBI相關凝血功能障礙機制的新方向。
　　方法:1)建立中型TBI小鼠模型，應用流式細胞儀和活化因子X凝血時間實驗，檢測TBI小鼠循環(huán)血中BDMP含量及凝血功能的變化;2)應用腦組織勻漿分步離心的方法體外制備BDMP;3)應用透射電鏡、流式細胞儀和Western Blot方法鑒定所得BDMP的形態(tài)學

3、及表型;4)應用活化因子X凝血時間實驗和凝血酶生成實驗，體外檢測BDMP的促凝作用;5)經(jīng)鼠尾靜脈注射BDMP到正常小鼠體內(nèi)，應用活化因子X凝血時間實驗、血漿纖維蛋白原水平測定和病理PTAH染色方法，體內(nèi)檢測BDMP的促凝作用;6)應用流式細胞儀和掃描電鏡觀察BDMP與血小板的結合情況;7)應用流式細胞儀檢測BDMP對血小板的活化作用。8)應用Transwell小室系統(tǒng)檢測BDMP在血小板介導下穿透HUVEC細胞的能力;9)應用流式細胞

4、儀和活化因子X凝血時間實驗檢測Lactadherin蛋白對BDMP的清除作用。
　　結果:1)TBI小鼠循環(huán)血中BDMP呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在TBI后3h時其表達達到頂峰。小鼠TBI后3h的貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)其凝血時間明顯縮短，此時PPP中BDMP的表達最高。而在經(jīng)過超速離心將BDMP去除后，無MP血漿(MP-free plasma，MPFP)的凝血時間明顯延長;2)透射電鏡下BD

5、MP具有完整的膜結構，且表面表達大量的膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。流式細胞及Western Blot結果顯示BDMP表達大量的神經(jīng)元和膠質細胞特異性標記，而不表達血小板、紅細胞、白細胞和內(nèi)皮細胞的標志物。BDMP上磷脂酰絲氨酸(PS)和組織因子在體外具有促凝作用。最后將BDMP注射到正常小鼠體內(nèi)，小鼠PPP的凝血時間明顯延長，血漿纖維蛋白原明顯降低，組織中纖維素沉積明顯;

6、3)流式細胞儀和掃描電鏡觀察到BDMP能夠與血小板結合，其結合后可以促進血小板表面PS的表達增加，同時可以激活血小板，導致血小板活化標志P-選擇素表達增加和鈣離子內(nèi)流增加。反過來，激活的血小板可以介導BDMP穿透激活的HUVEC細胞;4)Lactadherin蛋白可以和BDMP結合，并在結合后減弱BDMP的促凝作用。
　　結論:1)TBI小鼠循環(huán)血中檢測到具有促凝活性的BDMP，可能是發(fā)生TBI相關凝血功能障礙的物質基礎;2)通過