rhEPO增加腦創(chuàng)傷小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平減輕TBI后神經(jīng)功能障礙的研究.pdf

1、研究目的:炎癥在創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的病理過(guò)程中促進(jìn)繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展，導(dǎo)致腦水腫的形成、局部腦組織的壞死、神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)功能的缺失。據(jù)相關(guān)報(bào)道，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是一類(lèi)具有下調(diào)過(guò)度炎癥反應(yīng)能力的淋巴細(xì)胞亞群。因此，有理由認(rèn)為T(mén)BI后通過(guò)外源性干預(yù)(如給予一定劑量重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)等）增加體內(nèi)Tregs的水平可能有利于減少創(chuàng)傷后過(guò)度炎癥反應(yīng)所致的繼發(fā)性腦水腫、神經(jīng)元的凋亡和局部腦組織的壞死，從而減輕由TBI

2、所致的空間學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)功能障礙。這將為T(mén)BI治療提供參考。
　　 研究方法:選用成年健康清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠，按照隨機(jī)化原則分為假手術(shù)(sham)組、腦創(chuàng)傷后重組人促紅細(xì)胞生成素(TBI+rhEPO)組和生理鹽水(saline)(TBI+saline)組。分組后建立小鼠液壓打擊腦創(chuàng)傷模型。rhEPO于模型制作成功后1小時(shí)經(jīng)腹腔注射。腦創(chuàng)傷小鼠于傷后24小時(shí)和傷后72小時(shí)處死。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)染色方法分別觀察

3、各組實(shí)驗(yàn)小鼠的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腦創(chuàng)傷后第24、72小時(shí)在外周脾臟和腦組織的變化情況。通過(guò)Morris水迷宮于各組小鼠傷后第7-12天進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)價(jià)。應(yīng)用干濕重法檢測(cè)各組小鼠傷后腦組織水腫情況。通過(guò)HE染色方法評(píng)估各組腦損傷小鼠傷后24和72小時(shí)腦組織壞死體積。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定各組小鼠腦組織中細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-1β和TNF-α變化情況。最后應(yīng)用免疫組織化學(xué)/免疫熒光方法檢測(cè)各組小鼠腦組織中MPO+細(xì)

4、胞、CD3+T細(xì)胞、cleave caspase-3+及小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。
　　 研究結(jié)果:小鼠體內(nèi)Tregs的水平在腦創(chuàng)傷后24小時(shí)各組之間比較無(wú)差異。小鼠腦創(chuàng)傷后72小時(shí)，與sham組相比，TBI+saline組中外周脾臟中Tregs的數(shù)量明顯減少(P＜0.05);與TBI+saline組相比， TBI+rhEPO組中Tregs的數(shù)量增多(P＜0.05)。在觀察腦組織中Tregs的浸潤(rùn)情況發(fā)現(xiàn):與sham組相比較，傷后72

5、小時(shí)TBI+saline組的Tregs明顯增多(P＜0.05);與TBI+saline組相比較，TBI+rhEPO組中Tregs的數(shù)量增多(P＜0.05)。干濕重法觀察發(fā)現(xiàn):在傷后24和72小時(shí)，與sham組相比，TBI+saline組腦水含量增加明顯(P＜0.05);與TBI+saline組相比較，TBI+rhEPO組腦組織的水含量明顯減少(P＜0.05)。對(duì)小鼠腦損傷后壞死體積檢測(cè):傷后72小時(shí)，TBI+rhEPO組小鼠腦壞死體積較

6、TBI+saline組小鼠明顯減少(P＜0.05)。腦創(chuàng)傷后，TBI+saline組小鼠在訓(xùn)練第二天后逃避潛伏期開(kāi)始明顯長(zhǎng)于sham組(P＜0.05);而TBI+rhEPO與TBI+saline組相比，TBI+rhEPO組在訓(xùn)練第二天逃避潛伏期開(kāi)始短于TBI+saline組(P＜0.05)。觀察腦組織中的炎癥細(xì)胞發(fā)現(xiàn):傷后72小時(shí)，TBI+rhEPO組腦組織中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞及CD3陽(yáng)性細(xì)胞的浸潤(rùn)均較TBI+saline組減少(P＜0.

7、05);而中性粒細(xì)胞則在傷后24小時(shí)浸潤(rùn)增多，持續(xù)到傷后72小時(shí)，但呈下降趨勢(shì)，TBI+rhEPO組較TBI+saline組減少(P＜0.05)。應(yīng)用ELISA檢測(cè)技術(shù)觀察創(chuàng)傷側(cè)的促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)和抗炎細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn):在傷后24小時(shí)和72小時(shí)，TBI+rhEPO組中IL-10和TGF-β的表達(dá)水平均較TBI+saline組增高(P＜0.05);而IL-1β和TNF-α的表達(dá)在TBI+

8、rhEPO組中卻降低(P＜0.05)。觀察小鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn):與sham組相比，TBI+saline組中神經(jīng)元凋亡在第72小時(shí)增多(P＜0.05);與TBI+saline組相比，TBI+rhEPO組腦創(chuàng)傷周?chē)黠@減少神經(jīng)元的凋亡(P＜0.05)。
　　 研究結(jié)論:rhEPO治療小鼠腦創(chuàng)傷后增加體內(nèi)Tregs的水平能夠抑制TBI后發(fā)生的過(guò)度炎癥反應(yīng)，從而減輕腦組織水腫，減少局部腦組織的壞死和神經(jīng)元凋亡，達(dá)到減輕TB