SIRT1通路在大鼠腦出血繼發(fā)性線粒體功能障礙及神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：腦出血（(intracerebralhemorrhage,ICH)是中老年人常見(jiàn)的急性腦血管疾病，具有高病死率和高致殘率，是我國(guó)腦血管疾病中死亡率最高的臨床類(lèi)型。雖歷經(jīng)多年研究，但至今發(fā)病機(jī)制不甚清楚，治療手段有限。近年來(lái)研究表明，血腫周?chē)鷰芰看x障礙在腦出血繼發(fā)性損傷中起著重要的作用。腦出血后能量代謝原料的供應(yīng)中斷，引起能量代謝障礙能量物質(zhì)匱乏，啟動(dòng)腦出血后的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)。線粒體作為細(xì)胞有氧呼吸和能量供應(yīng)的場(chǎng)所，其結(jié)構(gòu)和功能受

2、損與腦出血所引起的能量代謝障礙密切相關(guān)，同時(shí)線粒體功能障礙可啟動(dòng)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)線粒體功能障礙及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是腦出血的重要致病機(jī)制，也有望成為治療腦出血的重要靶點(diǎn)。越來(lái)越多研究顯示，Silent information regulator1(SIRT1)參與體內(nèi)線粒體功能障礙的修復(fù)，并在多種神經(jīng)退行性疾病中具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。然而SIRT1在大鼠腦出血繼發(fā)性損傷的保護(hù)作用及其可能的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。

3、
　　目的：探討SIRT1在大鼠腦出血繼發(fā)性損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能的相關(guān)調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　?。?）構(gòu)建大鼠腦出血模型，于建模后腹腔注射SIRT1激動(dòng)劑SRT17205mg/kg/d直至建模后48h。觀察激動(dòng)SIRT1對(duì)大鼠腦出血后神經(jīng)學(xué)功能、腦水腫含量、形態(tài)學(xué)的影響，并通過(guò)電子顯微鏡對(duì)血腫周?chē)€粒體形態(tài)學(xué)的觀察、線粒體ATP和線粒體DNA的測(cè)定評(píng)價(jià)激動(dòng)SIRT1對(duì)大鼠腦出后繼發(fā)性線粒體功能障礙的神經(jīng)保護(hù)作

4、用。采用real-time qPCR和Western Blot檢查SIRT1在大鼠腦出血后核內(nèi)及總蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)通過(guò)Western Blot檢測(cè)AMPK及p-AMPK的表達(dá)情況。
　?。?）于構(gòu)建大鼠腦出血模型后激動(dòng)SIRT1，采用Western Blot檢測(cè)PGC-1α核內(nèi)及總蛋白表達(dá)水平，線粒體電子傳遞鏈相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)采用免疫共沉淀(IP)檢測(cè)乙?；疨GC-1α的表達(dá)水平。
　?。?）構(gòu)建一

5、條化學(xué)合成的陰性對(duì)照siRNA和三條PGC-1αsiRNA，建立大鼠腦出血模型，建模前24小時(shí)行側(cè)腦室注射siRNA，同時(shí)于建模后腹腔注射SRT1720。采用real-time qPCR和Western Blot檢測(cè)PGC-1α siRNA干擾片段的干擾效率，并選出最有效的PGC-1αsiRNA干擾片段。檢測(cè)PGC-1α基因干擾后線粒體電子傳遞鏈相關(guān)蛋白及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　?。?）構(gòu)建一條化學(xué)合成陰性對(duì)照siR

6、NA和三條SIRT1 siRNA，建立大鼠腦出血模型，建模前24小時(shí)行側(cè)腦室注射siRNA。采用real-time qPCR和Western Blot檢測(cè)SIRT1 siRNA干擾片段的干擾效率，并選出最有效的SIRT1 siRNA干擾片段。觀察SIRT1基因干擾后對(duì)大鼠腦出血后神經(jīng)學(xué)功能、腦水腫含量、形態(tài)學(xué)的影響。通過(guò)電子顯微鏡檢測(cè)血腫周?chē)€粒體形態(tài)變化，同時(shí)測(cè)定線粒體ATP和線粒體DNA含量。Western Blot檢測(cè)PGC-1α

7、、線粒體電子傳遞鏈相關(guān)蛋白及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）激動(dòng)SIRT1明顯緩解大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺失，減少大鼠腦含水量，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷,緩解線粒體水腫，增加線粒體ATP含量及線粒體DNA含量。激動(dòng)SIRT1可引起SIRT1總蛋白、SIRT1核內(nèi)蛋白及mRNA表達(dá)增加。誘導(dǎo)PGC-1α、去乙?；疨GC-1α及線粒體電子傳遞鏈相關(guān)蛋白表達(dá)增高，而凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)降低。
　?。?）干擾PGC

8、-1α可抑制由SRT1720誘導(dǎo)的PGC-1α及線粒體電子傳遞鏈相關(guān)蛋白表達(dá)增高，同時(shí)引起線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高。
　?。?）干擾SIRT1促進(jìn)大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺失，增加大鼠腦含水量，增加神經(jīng)細(xì)胞損傷,增加線粒體水腫，減少線粒體ATP含量及線粒體DNA含量。同時(shí)減少SIRT1蛋白及mRNA表達(dá)水平，抑制PGC-1α及線粒體電子傳遞鏈相關(guān)蛋白表達(dá)增高，增加凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：SIRT1通過(guò)恢復(fù)提