TENS及COFFEE OR CAFFEINE對(duì)DCP干預(yù)機(jī)制的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病，糖尿病性神經(jīng)病變是糖尿病慢性并發(fā)癥中發(fā)病率最高的一種，糖尿病膀胱?。╠iabetic cystopathy， DCP）是糖尿病外周神經(jīng)病變的一種，屬于神經(jīng)源性膀胱尿道功能障礙（Neuropathic dysfunction of bladder，NB）。作為糖尿病引起的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥，其發(fā)病率占糖尿病患者的50％左右。臨床研究顯示即使對(duì)于那些血糖控制穩(wěn)定的患者，仍有25％的DCP發(fā)病率。 尋找有

2、效的方法，盡早積極預(yù)防和治療糖尿病膀胱病變，改善下尿路癥狀，是糖尿病患者綜合治療及提高生活質(zhì)量的重要組成部分。目前糖尿病神經(jīng)病變的治療主要集中在藥物治療，藥物治療雖有一定效果，但副作用不可忽視。另外，有創(chuàng)治療包括間歇清潔導(dǎo)尿、膀胱造瘺術(shù)、尿道膀胱頸切開(kāi)等方法，可緩解大量剩余尿的問(wèn)題，改善剩余尿造成的尿路感染和上尿路損傷，但治標(biāo)不治本，且處理不當(dāng)易招致進(jìn)一步的感染。如何找到有效、安全的預(yù)防、治療DCP病變，解除DCP逼尿肌無(wú)力、剩余尿多，

3、一直是人們?cè)谔剿鞯膯?wèn)題。早期積極預(yù)防DCP的發(fā)生和發(fā)展，是糖尿病患者綜合治療及提高生活質(zhì)量的關(guān)鍵所在。 使用體外電脈沖刺激（Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation，TENS）技術(shù)治療DCP報(bào)道甚少，且尚無(wú)其尿動(dòng)力學(xué)及機(jī)制方面的研究。另研究發(fā)現(xiàn)常飲咖啡可降低2型糖尿病的發(fā)病率，咖啡因?qū)μ悄虿“螂撞〉淖饔萌绾?？有待觀察。 本研究通過(guò)制備糖尿病膀胱的大鼠模型，采用體外脈沖電刺激（

4、TENS）的方法，及采用coffee or caffeine對(duì)DCP大鼠給予咖啡因水溶液（10mg·kg-1·d-1）及雀巢咖啡水溶液經(jīng)口灌胃干預(yù)治療，觀察對(duì)糖尿病膀胱大鼠的排尿功能的影響，進(jìn)一步通過(guò)尿動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究，從神經(jīng)源性和肌源性兩方面探討TENS及coffee or caffeine對(duì)于糖尿病膀胱的作用機(jī)制及療效。對(duì)今后臨床應(yīng)用TENS技術(shù)（經(jīng)體表）治療糖尿病膀胱病病變的患者及通過(guò)每日飲用適量咖啡來(lái)

5、阻止糖尿病膀胱病病變的進(jìn)一步發(fā)展，減少膀胱剩余尿（BRU），提供幫助。這將是簡(jiǎn)便而經(jīng)濟(jì)的方法，可取得較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 第一部分、DCP動(dòng)物模型的建立和尿動(dòng)力學(xué)及病理組織學(xué)觀察。 目的：掌握建立DCP大鼠模型的方法，為下一步干預(yù)性研究打下基礎(chǔ)。觀察DCP的尿動(dòng)力學(xué)及病理學(xué)改變，初步探討發(fā)病機(jī)制及病理演繹過(guò)程，為診治提供依據(jù)。 方法：66只SD雄性大鼠隨機(jī)分為2組，即正常對(duì)照組（NC組）30只，糖尿病組（D

6、M組）36只、對(duì)36只8周齡的SD雄性大鼠腹腔注射STZ （60 mg/Kg）的檸檬酸緩沖液48小時(shí)后，鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，以連續(xù)3次測(cè)空腹血糖>12mmol·L-1為糖尿病模型建立成功。飼養(yǎng)60天后，進(jìn)行膀胱靜態(tài)壓、最大膀胱容量、最大膀胱收縮壓等尿動(dòng)力學(xué)測(cè)定。然后行膀胱濕重、膀胱壁厚度及光鏡、電鏡的病理學(xué)等項(xiàng)觀察。 結(jié)果：DM組36只SD雄性大鼠48小時(shí)后，有33只大鼠空腹測(cè)尾靜脈血糖>12mmol·L-1，

7、糖尿病模型成功率達(dá)91.67％，至實(shí)驗(yàn)60天糖尿病大鼠總共死亡9只，存活率達(dá)72.73％。60天后，DCP鼠膀胱靜態(tài)壓0.95±0.10 kpa，對(duì)照組為0.60±0.03 kpa（P<0.05）； DCP鼠最大膀胱容量3.49±0.40ml，而對(duì)照組為1.82±0.12ml （P<0.01）； DCP鼠最大膀胱收縮壓3.09±0.10 kpa，對(duì)照組為4.91±0.30 kpa （P<0.01）； DCP鼠膀胱順應(yīng)性（ml/kpa）

8、1.39±0.11 ml/kpa，對(duì)照組為0.68±0.07 ml/kpa （P<0.01）；與對(duì)照組鼠相比，DCP鼠濕重，膀胱壁厚度均增加（P<0.05）； DCP鼠逼尿肌邊緣有空泡樣變性，肌細(xì)胞核核固縮、細(xì)胞連接纖維化，成纖維細(xì)胞變性及膠原纖維排列紊亂。 結(jié)論：DCP大鼠60天已有膀胱的動(dòng)力學(xué)及病理學(xué)改變，提示盡管一些DM患者可無(wú)明顯的排尿障礙，但客觀的病理組織及尿動(dòng)力學(xué)已有改變，建議對(duì)DCP患者應(yīng)給予干預(yù)，控制病情的進(jìn)一步

9、惡化。 第二部分、TENS與非TENS對(duì)DCP干預(yù)的對(duì)照基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。 目的：通過(guò)制作的糖尿病膀胱大鼠模型，探討體外電刺激的方法對(duì)糖尿病膀胱大鼠的排尿功能的影響及作用機(jī)理。 方法：將SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）14只、糖尿病對(duì)照組（DM組）和糖尿病電刺激組（DM治療組），后二組各18只，運(yùn)用腹腔內(nèi)注射STZ的方法制作糖尿病膀胱大鼠模型：造模成功后第10周起，DM治療組予體外電刺激治療，刺激參數(shù)強(qiáng)度31

10、 V，密度31 Hz（二對(duì)電極分別置于膀胱體表投影區(qū)和骶尾關(guān)節(jié)上方0.5厘米處），其它二組均不予電刺激，持續(xù)治療3周后（造模成功后第13周起）觀察比較各組間尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改變（膀胱濕重，膀胱閾容量，排尿后剩余尿量，剩余尿比值，排尿時(shí)最大膀胱壓力），逼尿肌肌條收縮功能及膀胱組織光鏡及超微結(jié)構(gòu)的變化，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）半定量測(cè)定背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的mRNA含量，運(yùn)用Western-blot

11、方法檢測(cè)各組大鼠膀胱壁及DRG的CGRP蛋白的表達(dá)量的變化。 結(jié)果：DM治療組大鼠與DM組大鼠相比，其膀胱收縮力增強(qiáng)（DM組：19.49±6.51mmHg； DMT組：30.0±3.84 mmHg）剩余尿量比（R％）有所下降（DM組：42.83±8.71；DMT組：32.82±6.72），膀胱排尿閾容量減少（DM組：1.4±0.40ml； DMT組：0.93±0.26ml），各組間其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組織病理學(xué)顯示DM組大鼠的

12、逼尿肌肌細(xì)胞代償性肥大，胞內(nèi)線粒體腫脹，細(xì)胞間質(zhì)與膠原纖維增生明顯；DM治療組大鼠的逼尿肌肌細(xì)胞肥大明顯減輕，胞內(nèi)線粒體無(wú)明顯腫脹，細(xì)胞間質(zhì)及膠原纖維增生不明顯。DM治療組大鼠膀胱壁及背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的CGRP蛋白表達(dá)含量較DM組明顯增加，DM治療組大鼠RT-PCR結(jié)果顯示其DRG的CGRP的mRNA含量也較DM組明顯增多。 結(jié)論：體外電刺激治療可以①促進(jìn)糖尿病膀胱大鼠膀胱壁和DRG的CGRP蛋白的合成，并有效的運(yùn)輸至膀胱壁

13、發(fā)揮作用，改善膀胱充盈感覺(jué)功能，恢復(fù)排尿功能的始動(dòng)因素；②修復(fù)胞漿內(nèi)線粒體等細(xì)胞器的正常結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的濃度，從而增強(qiáng)逼尿肌收縮力；③促進(jìn)NGF因子，或神經(jīng)損傷/再生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，幫助完成神經(jīng)的修復(fù)過(guò)程。 第三部分、coffee or caffeine對(duì)DCP作用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。 目的：通過(guò)建立的糖尿病大鼠動(dòng)物模型，觀察糖尿病大鼠膀胱的形態(tài)、功能及組織病理學(xué)變化，探討咖啡與咖啡因?qū)μ悄虿〈笫蟀螂坠δ苷系K的

14、影響及可能的作用機(jī)制。 方法：75只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組（NC組）15只，糖尿病組（DM組）、糖尿病咖啡治療組（Coffee組）及糖尿病咖啡因治療組（Caffeine組）每組各20只。鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，以連續(xù)3次測(cè)空腹血糖>12mmol·L-1為糖尿病模型建立成功。Caffeine組大鼠給予咖啡因水溶液（10mg·kg-1·d-1）經(jīng)口灌胃，Coffee組大鼠給予雀巢咖啡水溶液（286mg·

15、kg-1·d-1）經(jīng)口灌胃，其余兩組以等量蒸餾水每日經(jīng)口灌胃，連續(xù)7周。7周后通過(guò)尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)、離體肌條的收縮實(shí)驗(yàn)、放免測(cè)定及組織病理學(xué)檢查等技術(shù)，測(cè)定并比較各組大鼠的膀胱濕重量、膀胱閾容量、相對(duì)排尿量（V％）、排尿后的剩余尿量、膀胱環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量、逼尿肌肌條的收縮力、背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的CGRP蛋白表達(dá)、膀胱組織光鏡及超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果：7周后相對(duì)于NC組大鼠，DM組大鼠的膀胱濕重量、膀胱閾容量及排尿后的剩余

16、尿量明顯增加（P<0.01），而V％與膀胱cAMP含量顯著減少（P<0.01）。與DM組相比，Coffee組或Caffeine組糖尿病大鼠的膀胱濕重量、膀胱閾容量及排尿后的剩余尿量顯著減少（P<0.05），V％與膀胱cAMP含量明顯升高（P<0.05）。肌條收縮實(shí)驗(yàn)顯示與NC組相比，DM組大鼠早期逼尿肌肌條的收縮力已明顯改變（P<0.05）；在Coffee組或Caffeine組，糖尿病大鼠逼尿肌肌條的收縮性明顯改善（P<0.05）。組織

17、病理學(xué)研究顯示DM組大鼠的逼尿肌肌細(xì)胞代償性肥大，胞內(nèi)肌漿網(wǎng)代償性增多，線粒體腫脹，細(xì)胞間質(zhì)與膠原纖維增生明顯；在Coffee組或Caffeine組，糖尿病大鼠的逼尿肌肌細(xì)胞肥大明顯減輕，胞內(nèi)肌漿網(wǎng)明顯減少，線粒體無(wú)腫脹，細(xì)胞間質(zhì)與膠原纖維增生不明顯。 結(jié)論：咖啡與咖啡因的治療能改善糖尿病大鼠膀胱病變，咖啡可能通過(guò)其中的咖啡因可以增加糖尿病膀胱大鼠膀胱壁和DRG的CGRP蛋白、CGRP的mRNA的表達(dá)、增加逼尿肌收縮力及膀胱的充