小檗堿抑制植物根生長的機(jī)理研究.pdf

1、小檗堿（Berberine）是一種常見的異喹啉生物堿，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。本文以三葉鬼針草（Bidens pilosa L.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）和煙草BY-2懸浮細(xì)胞（Nicotiana tabacum Brightyellow-2）為材料，研究了小檗堿的生物活性、吸收傳導(dǎo)和作用機(jī)理，為小檗堿作為一種新的植物源除草劑的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)根據(jù)。
　　小檗堿、草甘膦（Glyphosat

2、e）、二甲戊靈（Pendimethalin）和2,4-D處理三葉鬼針草7 d后，對(duì)三葉鬼針草根長的IC50值分別是3.27、3.45、6.97和0.23 mg·L-1，對(duì)三葉鬼針草鮮重的IC50值分別是6.11、7.72、15.21和0.92 mg·L-1；小檗堿、草甘膦、二甲戊靈和2,4-D處理擬南芥7 d后，對(duì)擬南芥根長的IC50值分別是0.25、0.52、3.51和0.0024 mg·L-1，對(duì)擬南芥鮮重的IC50值分別是6.00

3、、5.25、13.74和1.21 mg·L-1，可以看出，小檗堿對(duì)三葉鬼針草和擬南芥的室內(nèi)除草活性與草甘膦和二甲戊靈相當(dāng)。
　　以0、5、10、20、40和80 mg·L-1的小檗堿處理煙草細(xì)胞1 d后，細(xì)胞死亡率分別為7.45％、9.90%、14.29%、30.99%、53.08%和63.76%；處理2 d后，細(xì)胞死亡率分別為8.52%、11.97%、19.69%、35.91%、60.36%和78.47%。對(duì)照藥劑草甘膦在5、1

4、0、20、40和80 mg·L-1的濃度下處理煙草細(xì)胞1 d后，細(xì)胞死亡率分別為9.40%、20.03%、31.23%、43.18%和55.75%；處理2 d后，細(xì)胞死亡率分別為11.21%、26.08%、39.11%、48.03%和61.65%?？梢钥闯觯￠迚A對(duì)煙草細(xì)胞的活性與草甘膦相當(dāng)。
　　由于小檗堿具有和常用商品化除草劑草甘膦和二甲戊靈相當(dāng)?shù)氖覂?nèi)生物活性，因此，研究小檗堿的吸收傳導(dǎo)相關(guān)特性，對(duì)小檗堿的田間應(yīng)用具有重要的指

5、導(dǎo)意義。以32 mg·L-1的小檗堿通過水培、涂莖和涂葉等不同施藥方式處理4~6葉期的三葉鬼針草幼苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水培的植株被顯著抑制，1、2、3、5和7 d，隨著時(shí)間的增加，根長、株高、根鮮重和整株鮮重的抑制率持續(xù)上升，但涂莖和涂葉兩種方法并沒有造成明顯抑制。采用水培法和葉片涂藥法研究小檗堿在三葉鬼針草植株內(nèi)的傳導(dǎo)，通過HPLC分析，32 mg·L-1的小檗堿水培三葉鬼針草幼苗0.5、1、2、3、5和7 d后，根中小檗堿濃度分別為51.6

6、9、63.59、76.74、50.45、38.33和27.38μg·g-1，莖中小檗堿濃度分別為6.41、8.05、12.33、19.23、14.58和9.09μg·g-1，葉中小檗堿濃度分別為0、0、2.76、3.17、3.14和2.63μg·g-1，隨著時(shí)間的延長，在根、莖、葉中均能檢測到小檗堿；而采用葉片涂藥法處理，經(jīng)過0.5、1、2、3、5和7 d后，只在三葉鬼針草的葉部檢測到小檗堿。由此可看出，小檗堿主要通過植物的根部吸收并進(jìn)

7、行傳導(dǎo)，在三葉鬼針草植株內(nèi)有自下而上的傳導(dǎo)性，而沒有自上而下的傳導(dǎo)性。進(jìn)一步用32 mg·L-1的小檗堿通過水培法處理4葉期的三葉鬼針草0.5、1、2、3和5 d后，切片后，采用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，小檗堿主要通過植物維管束從根向莖葉進(jìn)行傳導(dǎo)，結(jié)果表明小檗堿是通過質(zhì)外體系傳導(dǎo)。
　　以模式植物擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行作用機(jī)理初步研究表明，小檗堿能顯著抑制擬南芥主根的生長，使擬南芥根尖分生區(qū)皮層的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。由于生長素在根形態(tài)建成中

8、具有重要意義，所以我們推測小檗堿可能對(duì)根部細(xì)胞分裂素和生長素運(yùn)輸系統(tǒng)產(chǎn)生了影響。以野生型擬南芥及其生長素響應(yīng)元件轉(zhuǎn)基因系（DR5:GUS）和細(xì)胞周期蛋白轉(zhuǎn)基因系（CYCB1:GUS）為實(shí)驗(yàn)材料研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿影響了生長素在擬南芥根尖部位的分布和含量，影響了CYCB1在擬南芥根部的表達(dá)，且研究結(jié)果還提示小檗堿除草可能與對(duì)照藥劑草甘膦和二甲戊靈，存在截然不同的作用機(jī)制，值得深入研究。
　　以擬南芥PIN1:GFP和PIN2:GFP標(biāo)記

9、系為實(shí)驗(yàn)材料研究發(fā)現(xiàn)，10 mg·L-1小檗堿影響了PIN1和PIN2在根尖的表達(dá)量，并使PIN1喪失在細(xì)胞膜上的極性定位功能。進(jìn)一步的RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對(duì) PIN1、IAA14、AIR1、AUX1、PIN3和 PIN7基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)能夠產(chǎn)生一定的影響。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)2 mg·L-1的小檗堿可使擬南芥根尖分生區(qū)內(nèi)皮層的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，但在此濃度下，對(duì)生長素在根尖的分布和含量的影響并不十分明顯，所以我們推測，植物最初響應(yīng)小檗堿的

10、靶標(biāo)可能并不在生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。由于小檗堿導(dǎo)致 PIN1喪失在細(xì)胞膜上的定位功能，由此推測，其作用位點(diǎn)可能位于細(xì)胞膜系統(tǒng)。
　　因此，以煙草細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)一步研究了小檗堿對(duì)細(xì)胞膜的影響。以0、5、10、20、40和80 mg·L-1小檗堿處理煙草細(xì)胞8 h后，以流式細(xì)胞儀測定了煙草細(xì)胞線粒體膜電位的變化，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值分別為92.80、89.31、89.87、87.79、76.64和72.34，隨著濃度的升高，處理組熒光強(qiáng)

11、度峰均有所下降，其中40和80 mg·L-1處理的與對(duì)照差異顯著，小檗堿對(duì)煙草細(xì)胞線粒體膜電位影響顯著，但并不能誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡，可以看出，小檗堿對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)產(chǎn)生了影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了小檗堿對(duì)細(xì)胞膜組成成分的影響。采用12.5~200 mg·L-1的小檗堿水培處理8葉期的三葉鬼針草植株后，收集根部樣品，用GC-MS測量樣品中脂肪酸的含量，在三葉鬼針草根中，脂肪酸組分最多的是棕櫚酸（C16）和硬脂酸（C18），約占總脂肪酸的55

12、％，小檗堿能顯著的影響根中脂肪酸的含量；經(jīng)12.5~50 mg·L-1的小檗堿處理后，IUFA百分比逐漸增大，但濃度從50~200 mg·L-1逐漸升高時(shí)IUFA百分比逐漸減少，結(jié)果表明，一定濃度的小檗堿會(huì)造成三葉鬼針草不可逆變化，IUFA百分比持續(xù)下降，從而影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，造成質(zhì)膜過氧化。
　　進(jìn)一步研究小檗堿對(duì)細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)影響結(jié)果表明，煙草細(xì)胞經(jīng)小檗堿處理后采用DAPI染色研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的小檗堿（40和80 mg·

13、L-1）嚴(yán)重影響了煙草細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)，細(xì)胞核出現(xiàn)不規(guī)則形狀、顆?；?。通過SEM（掃描電鏡）和TEM（透射電鏡）分析三葉鬼針草和擬南芥的根尖表面及分生區(qū)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)0.5 mg·L-1的小檗堿可使擬南芥分生區(qū)細(xì)胞中的線粒體數(shù)量明顯減少，隨著小檗堿濃度的增加，可以使根尖表面出現(xiàn)明顯的凹陷和分生區(qū)細(xì)胞壞死等。TEM分析小檗堿對(duì)煙草細(xì)胞影響的結(jié)果表明，隨著小檗堿濃度的增加及處理時(shí)間的延長，煙草細(xì)胞變形和質(zhì)壁分離現(xiàn)象越來越明顯，線粒體和細(xì)胞壁等

14、的降解也越明顯。
　　綜上所述，植物源除草化合物小檗堿具有與草甘膦和二甲戊靈相當(dāng)?shù)氖覂?nèi)除草活性。其主要作用位點(diǎn)在植物根部，由根吸收后自下而上傳導(dǎo)，先引起根部的生長受到抑制，隨后可引起整株的生長受到抑制。小檗堿能顯著影響植物細(xì)胞分裂，影響生長素輸出載體蛋白 PIN1在細(xì)胞膜上的極性定位功能，引起線粒體膜電位的變化，破壞根部IUFA的平衡，引起細(xì)胞膜質(zhì)過氧化。小檗堿雖然不能引起植物細(xì)胞凋亡，但可引起植物細(xì)胞直接壞死。植物響應(yīng)小檗堿的最