小檗堿對膀胱癌的抑制作用及其機制研究.pdf

1、膀胱癌是世界上第九大惡性腫瘤，在我國泌尿系統(tǒng)的腫瘤中占第一位，大約每年有356，000例（男性274，000例，女性83，000例）患者發(fā)生膀胱癌，2007年統(tǒng)計在中國城市男性膀胱癌年齡標(biāo)準(zhǔn)死亡率為3.54/100，000，女性為1.19/100，000，在農(nóng)村其比率為1.92/100，000和0.52/100，000。各級別的膀胱癌治療方式不同，大約70～85％的膀胱癌患者屬于淺表型膀胱癌，經(jīng)診斷后通過經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TURBT

2、)治療。然而，術(shù)后膀胱癌復(fù)發(fā)率很高，需給予患者膀胱灌注藥物以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。大部分膀胱灌注藥物如卡介苗(BCG)，表柔比星，吡柔比星等用于術(shù)后預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)。這些藥物通常價格昂貴，并且會產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥，如尿頻，尿急，尿痛，血尿和免疫抑制等，因此需要尋找一種有效但副作用較少的藥物。
　　 小檗堿是從中草藥黃連素中提取的季胺型異喹啉類生物堿，又稱為黃連素，是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)消炎及抗菌藥物，近年來有研究表明其具有明顯的抗腫瘤作用，已經(jīng)在

3、尤文肉瘤，乳腺癌，食管癌和前列腺癌中發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤的作用。小檗堿對人體正常細胞沒有毒性，但可以有效的殺滅腫瘤細胞。
　　 小檗堿能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞周期的G1期或G2期的停滯，并誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡。小檗堿能誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)依賴性的凋亡和caspase-9依賴性凋亡，因此我們認為小檗堿通過激活caspase-3和caspase-9使裂解后的caspase-3和-9表達增

4、強，進而使凋亡增強。通過MTT實驗，細胞周期分析及流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗，來研究小檗堿對膀胱癌細胞株的作用。我們的研究結(jié)果表明小檗堿誘導(dǎo)T24細胞凋亡是通過caspase的凋亡通路。
　　 膀胱癌T24細胞系中內(nèi)源性表達H-Ras，跟膀胱癌的分級和分期有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)有大于35％的膀胱癌病人中有表達。H-Ras是膜結(jié)合鳥苷三磷酸腺苷和鳥苷二磷酸結(jié)合蛋白(G)，起到分子開關(guān)的作用，將細胞膜表面的信號傳遞到細胞核內(nèi)，Ras可以通過升

5、高cyclinD1的水平導(dǎo)致G1期細胞擴增，對細胞自G1期進入S期有促進作用。C-fos是H-Ras的下游效應(yīng)基因，在眾多惡性腫瘤中起作用。因此本課題研究小檗堿對膀胱癌中H-Ras和c-fos表達抑制的研究，來進一步研究小檗堿抑制膀胱癌細胞的生長，促進細胞凋亡的機制。
　　 惡性腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移要穿透細胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜(BM)，擴散到周圍及遠處器官，在ECM和BM中含有大量的基質(zhì)分子如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、多種

6、膠原以及蛋白多糖等，穿越這些屏障需要相關(guān)的酶類，乙酰肝素酶(Hpa)就是一種具有這種功能的酶，它可以在特定的部位裂解HSPG和其硫酸乙酰肝素(HS)側(cè)鏈，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并通過釋放和活化肝素結(jié)合性生長因子如bFGF和VEGF等誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成。有研究表明小檗堿可以抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，但是小檗堿通過抑制乙酰肝素酶的表達來抑制轉(zhuǎn)移及侵襲的研究尚未報道，因此我們研究小檗堿對膀胱癌中乙酰肝素酶表達的作用，來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲。

7、
　　 第一部分：
　　 為了研究小檗堿抑制膀胱癌BIU-87及T24細胞增殖，誘導(dǎo)細胞周期的阻滯，并且誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生，我們給予淺表型膀胱癌細胞株BIU-87和浸潤型膀胱癌細胞株T24不同濃度的小檗堿藥物，作用一定時間后，通過四唑鹽比色法(MTT)實驗檢測膀胱癌細胞的存活情況，利用碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀分析膀胱癌細胞BIU-87和T24的細胞周期，利用AnnexinV-conjugatedAlexaFluo

8、r488(Alexa488)和PI進行雙染，通過流式細胞儀檢測并分析凋亡細胞的比例;提取小檗堿處理后的T24細胞中的mRNA和蛋白，利用RT-PCR及WesternBlot實驗檢測在膀胱癌T24細胞中表達的原癌基因H-Ras和c-fos，并利用Westernblot實驗檢測凋亡通路中caspase-3和caspase-9的表達。結(jié)果如下:
　　 1.四唑鹽比色法(MTT)實驗結(jié)果顯示，不同濃度小檗堿(0，1，5，10，25，50

9、，75，及100μg/mL)處理膀胱癌細胞株BIU-87和T24細胞，小檗堿能夠抑制膀胱癌BIU-87及T24細胞的增殖，并呈劑量和時間依賴性。
　　 2.利用PCR在不同濃度及不同時間小檗堿抑制T24細胞中來檢測H-Ras和c-fos的表達。結(jié)果顯示，隨著小檗堿濃度的增加及處理時間的延長，在T24細胞中H-Ras和c-fos的mRNA的表達有明顯的逐漸減低趨勢。這些結(jié)果表明，小檗堿對H-Ras和c-fos的抑制具有濃度依賴性和

10、時間依賴性。
　　 3.Westernblot結(jié)果顯示，通過逐漸增加的濃度及時間小檗堿處理，在T24細胞中H-Ras和c-fos的蛋白的表達有明顯的逐漸減低趨勢，并具有時間和濃度依賴性。
　　 4.流式細胞儀可以分析小檗堿誘導(dǎo)細胞周期阻滯，結(jié)果分析表明，小檗堿處理的細胞停滯在G0/G1期，與未處理的細胞相比，隨著小檗堿濃度的增加，停滯在G0/G1期的細胞逐漸增多，并且具有濃度依賴性。
　　 5.我們通過對膀胱癌細

11、胞進行AlexaFluor488annexinV和PI雙染，流式結(jié)果顯示小檗堿可以誘導(dǎo)膀胱癌細胞株BIU-87和T24細胞的早期和晚期的凋亡，并且有濃度依賴性。
　　 6.為了研究含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）和caspase-9是否在細胞凋亡中起作用，我們用10μg/mL和25μg/mL濃度的小檗堿處理T24細胞，并測定caspase-3和caspase-9蛋白水平。Westernblot結(jié)果表明，p

12、rocaspase-3在處理前后沒有明顯區(qū)別，但caspase-3和caspase-9在處理后有明顯的升高。這些結(jié)果表明小檗堿誘導(dǎo)T24細胞凋亡是由激活caspase-3和caspase-9的機制來完成的。
　　 以上結(jié)果表明小檗堿能夠通過抑制原癌基因H-Ras及其下游基因c-fos的表達，阻滯G0/G1細胞周期，誘導(dǎo)caspase-3和caspase-9依賴的細胞凋亡，從而抑制膀胱癌BIU-87和T24細胞的增殖，更有效的殺傷

13、膀胱癌細胞。因此，小檗堿對膀胱癌有抑制生長的作用，將來可作為一種新的膀胱癌的術(shù)后用藥。
　　 第二部分：
　　 乙酰肝素酶是一種降解細胞外基質(zhì)和基底膜的酶，與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤有關(guān)系，并且在膀胱癌中高表達，在膀胱癌細胞株T24中有高表達。本實驗采用siRNA技術(shù)干擾膀胱癌T24細胞內(nèi)乙酰肝素酶的表達，并對干擾后的膀胱癌細胞進行遷移和侵襲試驗。小檗堿對惡性腫瘤的遷移和轉(zhuǎn)移有抑制作用，用不同濃度小檗堿處理膀胱癌T24細胞，

14、采用Transwell小室，進行細胞遷移及侵襲實驗。我們假設(shè)小檗堿可以抑制與膀胱癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的乙酰肝素酶的表達，因此利用不同濃度小檗堿采用PCR及Westernblot等方法檢測其表達水平的變化。具體結(jié)果如下:
　　 7.PCR結(jié)果顯示，乙酰肝素酶在T24細胞中高表達，利用乙酰肝素酶的siRNA技術(shù)，通過脂質(zhì)體2000將hpa-siRNA轉(zhuǎn)染入T24細胞中，將T24細胞中肝素酶的基因敲除，發(fā)現(xiàn)與陰性對照相比，乙酰肝素酶表達明顯降低

15、，表面hpa-siRNA可以下調(diào)乙酰肝素酶的活性，使其表達降低。
　　 8.Westernblot結(jié)果顯示，乙酰肝素酶的蛋白在膀胱癌T24細胞中高表達，將利用siRNA敲除乙酰肝素酶的T24細胞的蛋白提取，并進行Westernblot實驗，結(jié)果顯示，與對照組相比，乙酰肝素酶的蛋白表達明顯降低。
　　 9.細胞遷移實驗的結(jié)果表明，乙酰肝素酶的siRNA可以降低膀胱癌T24細胞的遷移能力，與對照組相比較，轉(zhuǎn)染hpa-siRN

16、A的T24細胞，穿過transwell小室的細胞數(shù)目明顯減少。
　　 10.細胞侵襲實驗的結(jié)果顯示，乙酰肝素酶的siRNA可以降低膀胱癌T24細胞的侵襲能力。乙酰肝素酶siRNA處理過的T24細胞，與對照組相比，穿過鋪過ECM膠的小室到下層的細胞數(shù)目明顯減少。
　　 11.利用小檗堿處理膀胱癌T24細胞，逐漸增加的小檗堿的濃度，并處理不同時間，提取RNA并進行PCR試驗，結(jié)果顯示在T24細胞中乙酰肝素酶的mRNA的表達有

17、明顯的逐漸減低趨勢。這些結(jié)果表明，小檗堿對乙酰肝素酶的mRNA的表達具有抑制作用，并具有濃度依賴性和時間依賴性。
　　 12.Westemblot結(jié)果顯示，利用逐漸增加濃度的小檗堿處理膀胱癌T24細胞，并采取不同時間，在T24細胞中乙酰肝素酶的蛋白的表達有明顯的逐漸減低趨勢。這些結(jié)果表明，小檗堿能夠抑制乙酰肝素酶的蛋白的表達，并且具有濃度依賴性和時間依賴性。
　　 13.利用不同濃度的小檗堿處理的膀胱癌T24細胞，種植于

18、Transwell小室的上層，進行細胞遷移實驗，結(jié)果表明，穿過Transewell小室的T24細胞的數(shù)目，隨小檗堿濃度的增加而逐漸減少，因此可以推斷小檗堿可以抑制T24細胞的遷移能力。
　　 14.Transwell小室細胞侵襲試驗結(jié)果顯示，不同濃度小檗堿處理的T24細胞，穿過鋪過ECM膠的小室下層的細胞隨小檗堿濃度的增加而逐漸減少，因此小檗堿可以抑制T24細胞的侵襲能力。
　　 以上結(jié)果表明，小檗堿能夠下調(diào)膀胱癌細胞中

19、乙酰肝素酶mRNA和蛋白的表達，減少細胞外基質(zhì)和基底膜的分解，進而減弱膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力，由此推斷小檗堿可以減少膀胱癌的轉(zhuǎn)移及侵襲，減少膀胱癌的復(fù)發(fā)。因此，小檗堿能夠抑制膀胱癌的生長，并通過抑制乙酰肝素酶的表達來減少膀胱癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機會。
　　 綜上所述，我們的研究表明小檗堿通過抑制原癌基因H-Ras和c-fosmRNA和蛋白的表達，通過誘導(dǎo)G1細胞周期的阻滯，誘導(dǎo)依賴caspase-3和caspase-9通路的凋亡，