植物源藥物篩選及小檗堿抑制番茄早疫病菌作用機制的研究.pdf

1、番茄是世界上種植面積居于第二的農作物，番茄早疫病是番茄上的主要病害，造成全球性的番茄田間和產后巨大的經濟損失。番茄早疫病的防治迫在眉睫。目前番茄早疫病的防治手段主要為化學農藥，然而農藥殘留造成環(huán)境污染，人畜中毒以及致病菌抗藥性增加產生變種等一系列問題。經濟、安全、高效的植物源農藥恰恰能克服化學農藥的缺點，植物源農藥具有環(huán)境友好、對非靶標生物安全、不易產生抗性、作用方式特異、促進作物生長并提高抗病性、種類多、開發(fā)途徑多等特點。植物源農藥有

2、望成為代替化學農藥的新一代藥物。本課題研究的目的是尋找代替化學農藥的新型植物源農藥并探究其抗菌機制，為植物源農藥防治早疫病奠定基礎。本實驗設計與工作包括以下幾個方面的內容:
　　1.研究旨在尋找出防治番茄早疫病的經濟、安全、高效的植物源藥物。此部分測定了13種植物源藥物對番茄早疫病菌的抑制情況，小檗堿對番茄早疫病菌的抑制效果最好，對小檗堿進一步進行毒力測定，其EC50僅為60μg/mL，MIC為300μg/mL。在顯微鏡下觀察小檗

3、堿處理前后菌絲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)小檗堿處理后，菌絲表面變形，褶皺。把番茄早疫病菌轉接到番茄上進行活體實驗，番茄上產生病斑，說明此菌確實對番茄具有致病性。添加小檗堿后，病斑明顯變小，且當小檗堿濃度達到300μg/mL時，番茄基本不產生病斑，說明小檗堿確實能有效防治番茄早疫病。
　　2.通過上一部分中的研究，成功從13種植物源藥物中篩選到了有效抑制番茄早疫病菌的藥物小檗堿，EC50僅為60μg/mL，MIC為300μg/mL。本章成功篩選到與

4、小檗堿復配的5種植物源藥物，分別是藜蘆堿、白藜蘆醇、厚樸酚、百里酚和黑胡椒水提物。進一步對各物質進行毒力測定，EC50分別為180μg/mL、322μg/mL、245μg/mL、192μg/mL和0.16g/mL。兩種藥物聯(lián)合使用時可以發(fā)揮出比單一藥物更高的抑菌功效，這樣可以減少劑量，節(jié)約成本，本章成功篩選到與小檗堿復配產生協(xié)同增效的物質黑胡椒水提物。小檗堿與5種植物源藥物復配，結果顯示，當小檗堿與黑胡椒水提物復配比為5∶1時，產生協(xié)同

5、增效作用;小檗堿與黑胡椒水提物復配比為2∶3時，產生相加作用;當小檗堿與厚樸酚復配比為1∶5、1∶2和1∶1時產生相加作用，其他復配效果均為拮抗作用。
　　胡椒堿是黑胡椒中的主要抑菌成分，為確定黑胡椒中與小檗堿復配協(xié)同增效的成分，本研究對胡椒堿進行了毒力測定，發(fā)現(xiàn)其EC50為197μg/mL，與小檗堿進行復配，結果顯示胡椒堿與小檗堿復配沒有產生協(xié)同增效的效果。說明黑胡椒水提物中與小檗堿復配產生增效效應的有效成分不是胡椒堿，其具體成

6、分還有待探究。
　　3.目前對植物源藥物的抑菌機制尚不明確，有待深入研究。本小節(jié)對小檗堿抑制番茄早疫病菌(Alternaria alternata)的作用機制進行了探究。DARSTS是探究小分子靶蛋白的有效方法，設定不同的酶解時間及不同蛋白酶和蛋白質的比例，SDS-PAGE電泳后都沒有靶蛋白，說明小檗堿的抗菌靶點可能不是可溶性蛋白質。通過掃描電子顯微鏡觀察小檗堿作用前后菌絲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)小檗堿處理后，菌絲表面變得褶皺，凹陷，并且當小檗

7、堿濃度為120μg/mL,發(fā)現(xiàn)質壁分離現(xiàn)象，推測小檗堿通過抑制細胞膜來發(fā)揮抑菌功效。通過測定小檗堿處理前后電導率的大小，小檗堿處理的菌液電導率較空白對照變大，說明小檗堿造成胞內物質泄漏。測定小檗堿處理前后麥角甾醇的含量，小檗堿處理后的菌體麥角甾醇含量降低，說明小檗堿抑制麥角甾醇合成。
　　上述研究表明小檗堿作用于細胞膜，膜蛋白是A.alternata細胞膜重要組成部分，在致病性過程中起到非常重要的作用，研究A.alternata膜