小檗堿抑制腫瘤細(xì)胞Cyclin D1相關(guān)信號通路的研究.pdf

1、目前，腫瘤的發(fā)病率和死亡率在中國乃至世界仍居高不下，它不僅給患者本人及其家庭帶來巨大的痛苦，同時也對整個社會的發(fā)展與進(jìn)步造成極大的威脅。因此，尋求安全、有效、低毒的抗腫瘤藥物一直受到國內(nèi)外醫(yī)藥界專家學(xué)者的重視，而從天然化合物中開發(fā)此類藥物也成為研究熱點(diǎn)。所有癌細(xì)胞的一個特異性表型異常是細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)，細(xì)胞周期的調(diào)控與多種細(xì)胞內(nèi)信號通路有關(guān)，阻斷細(xì)胞內(nèi)信號通路從而抑制細(xì)胞周期正調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)是抑制腫瘤細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵。本研究在確定小

2、檗堿對腫瘤細(xì)胞周期的阻滯作用和對周期進(jìn)展關(guān)鍵蛋白Cyclin D1的抑制作用的基礎(chǔ)上，研究其對Cyclin D1相關(guān)信號通路的作用，探討小檗堿抑制Cyclin D1轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制，為闡明小檗堿阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為小檗堿抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分：研究小檗堿對人高轉(zhuǎn)移性肺癌PG細(xì)胞周期進(jìn)展和Cyclin D1表達(dá)的影響。 1．培養(yǎng)人高轉(zhuǎn)移性肺癌PG細(xì)胞，采用MTT

3、法檢測小檗堿對PG細(xì)胞增殖的作用。與對照組相比，經(jīng)不同濃度(10μg/ml，2μg/ml，40μg/ml)的小檗堿處理24小時和48小時，PG細(xì)胞生長明顯受到抑制。 2．流式細(xì)胞儀檢測小檗堿對PG細(xì)胞周期進(jìn)展的影響，結(jié)果表明，小檗堿可使G0/G1期細(xì)胞增多，而S期和G2/M期細(xì)胞減少，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)；小檗堿高低劑量組間有明顯差異(P<0.05)。 3．RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度小檗堿處理后2

4、4小時，PG細(xì)胞Cyclin D1的mRNA水平較對照組明顯降低。小檗堿對PG細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)有抑制作用。 第二部分：研究小檗堿對PG細(xì)胞Cyclin D1相關(guān)信號通路的作用。在確定小檗堿對腫瘤細(xì)胞周期的阻滯作用和對周期進(jìn)展關(guān)鍵蛋白Cyclin D1的抑制作用的基礎(chǔ)上，研究其對Cyclin D1相關(guān)信號通路的作用，探討小檗堿抑制Cyclin D1轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。 1．雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，小檗堿對PG細(xì)

5、胞AP-1，Wnt信號通路活性有明顯抑制作用，而對NF-кB信號通路影響不明顯。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)PDB+Ionomysin處理的PG細(xì)胞AP-1信號通路被激活，小檗堿能有效抑制這種激活，其作用呈劑量依賴性。 2．Western Blot檢測表明，經(jīng)不同濃度小檗堿處理后，PG細(xì)胞內(nèi)與Cyclin D1轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的AP-1轉(zhuǎn)錄因子組分c-Jun蛋白含量明顯降低，降低的水平與小檗堿濃度相關(guān)。 3．EMSA結(jié)果顯示，不同濃度

6、的小檗堿均能抑制PG細(xì)胞核提取物與帶有野生型AP-1位點(diǎn)的寡核苷酸結(jié)合；經(jīng)小檗堿處理后PG細(xì)胞核提取物與Cvclin D1上游啟動子區(qū)帶有AP-1位點(diǎn)的寡核苷酸結(jié)合減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示： 1．小檗堿通過抑制周期進(jìn)展關(guān)鍵蛋白Cvclin D1，阻滯PG細(xì)胞周期進(jìn)展，從而抑制PG細(xì)胞增殖。 2．小檗堿對Cyclin D1相關(guān)信號通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用，對NF-кB通路活性影響不明顯。小檗堿對異常激活的AP-1信