小檗堿對TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MRC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞信號通路相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：探討小檗堿(BBR)在轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)誘導(dǎo)的人肺癌上皮細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中和人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5轉(zhuǎn)分化過程中，對細(xì)胞外羥脯氨酸和細(xì)胞內(nèi)表征蛋白鈣粘蛋白(E-cadherin)、纖連蛋白(FN)和平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及MAPK信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平、Akt信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞，采用MTT法

2、檢測不同濃度BBR對細(xì)胞增殖的抑制作用，確定適合的實(shí)驗(yàn)用藥濃度;Western blot法檢測不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT和MRC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化表征蛋白E-cadherin、FN、α-SMA表達(dá)水平，確定適宜的TGF-β1誘導(dǎo)濃度。不同濃度BBR預(yù)處理的A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞，TGF-β1刺激后，采用比色法測定細(xì)胞外羥脯氨酸水平，對于細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、FN、α-SMA表達(dá)水平以及MAPK信號通路相關(guān)蛋白p3

3、8、ERK1/2、JNK和Akt的磷酸化水平，以及Snail的表達(dá)水平，均采用Western blot法進(jìn)行檢測。同時(shí)采用半定量PCR和Real-time PCR法，檢測了BBR對TGF-β1誘導(dǎo)的相應(yīng)細(xì)胞表征蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　結(jié)果：參考MTT法檢測結(jié)果，選定BBR適宜濃度（20、40、80μmol/L）進(jìn)行研究。Western blot結(jié)果顯示2ng/mL濃度TGF-β1可明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT，誘導(dǎo)MRC-

4、5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。BBR預(yù)處理的A549細(xì)胞，較單純TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞，培養(yǎng)液中羥脯氨酸水平明顯降低。Western blot法檢測結(jié)果顯示，高濃度BBR（80μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞較單純TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞，在一定程度抑制了FN的高表達(dá)水平，但不能逆轉(zhuǎn)E-cadherin的表達(dá)降低。BBR三個(gè)濃度(20、40、80μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞較單純TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞，對MAPK信號通路相關(guān)蛋白ERK1/2(Thr202/Tyr204)的

5、磷酸化水平均存在一定抑制作用，BBR(20μmol/L)對Snail存在一定抑制作用，但對p38、JNK磷酸化水平變化沒有明顯影響;另外，高濃度BBR(80μM)對p-Akt(Ser473)存在較明顯的促進(jìn)作用，使其表達(dá)量恢復(fù)至接近正常水平。BBR預(yù)處理的MRC-5細(xì)胞，較單純TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞，培養(yǎng)液中羥脯氨酸水平明顯降低。Western blot法檢測結(jié)果顯示，BBR預(yù)處理細(xì)胞較單純TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞，α-SMA、FN表達(dá)水平受

6、抑較明顯，MAPK信號通路相關(guān)蛋白p38、ERK1/2、JNK磷酸化水平亦受到不同程度抑制，Akt磷酸化水平和Snail表達(dá)水平也明顯受到抑制。
　　結(jié)論：BBR預(yù)處理對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的EMT過程有一定抑制作用，但不是很顯著，其抑制機(jī)制可能與上調(diào)Akt的磷酸化水平和抑制ERK1/2的磷酸化水平有關(guān);BBR預(yù)處理對TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5轉(zhuǎn)分化過程有較明顯抑制作用，其機(jī)制可能與BBR下調(diào)MAPK信號通路相關(guān)蛋白的