腫瘤壞死因子α信號通路主要受體銜接蛋白在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、本文的研究目的是觀察TNFα信號通路主要受體銜接蛋白在SLE患者外周血及腎臟組織的表達變化，探討其在SLE發(fā)病機制中的作用，為制定更有效的TNFα調(diào)節(jié)策略提供依據(jù)和治療靶點。 第一章 TNFα信號通路主要受體銜接蛋白在SLE患者外周血單個核細(xì)胞中的表達變化及其臨床意義 目的：探討TNFα信號通路主要受體銜接蛋白在SLE患者外周血單個核細(xì)胞中的表達變化及其臨床意義。 方法：收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的SLE住院患

2、者和健康志愿者外周靜脈血，分離血漿和PBMCs，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血漿中TNFα水平，采用半定量RT—PCR和實時熒光定量PCR檢測TNFα，TNFR1、TNFR2和上述四種受體銜接蛋白及Caspase3和白介素-1β的mRNA表達水平，比較SLE患者與健康志愿者之間以及不同狼瘡活動度SLE患者中上述四種受體銜接蛋白的表達差異，以及與狼瘡活動指數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。SLE活動性評估依據(jù)SLEDA1評分標(biāo)準(zhǔn)進行。 結(jié)果：SLE患

3、者血漿中TNFα的水平明顯高于正常對照者的水平。SLE患者PBMCs中Caspase3mRNA的表達明顯升高，而IL-1βmRNA的表達與正常對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。SLE患者PBMCs中TRADD、FADD、RIP和TRAF—2mRNA的表達與狼瘡活動指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為—0.285，—0.280，—0.307和—0.298. 小結(jié)：TNFα信號通路中主要的四種受體銜接蛋白TRADD、FADD、RIP和TRAF—

4、2mRNA在SLE患者PBMCs中的表達均降低，且與狼瘡活動指數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其異常表達可能參與了TNFα信號網(wǎng)絡(luò)紊亂所介導(dǎo)的SLE免疫病理損傷。 第二章 TNFα信號通路主要受體銜接蛋白在SLE患者外周血不同淋巴細(xì)胞亞群中的表達變化及其臨床意義 目的：探討TNFα信號通路TNFRs以及主要受體銜接蛋白—TRADD、RIP和TRAF—2在SLE患者外周血不同淋巴細(xì)胞亞群中的表達變化及其臨床意義。 方法：收集加拿大

5、多倫多大學(xué)附屬西區(qū)醫(yī)院確診的SLE住院患者和健康志愿者外周靜脈血，采用實時熒光定量PCR檢測外周靜脈全血中TNFα、TNFRs和受體銜接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2mRNA的表達水平。分離出血清和PBMCs，采用ELISA檢測血清中TNFα的水平，采用特異性CD分子抗體標(biāo)記淋巴細(xì)胞亞群，多通道流式細(xì)胞術(shù)檢測TNFRs和上述三種主要受體銜接蛋白及活化的Caspase3表達水平，分析比較這些信號分子在SLE患者與健康志愿者之間不同淋

6、巴細(xì)胞亞群中的表達差異，以及與狼瘡活動指數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。SLE活動性評估依據(jù)SLEDAI評分標(biāo)準(zhǔn)進行。 結(jié)果：SLE患者血清中TNFα的水平顯著高于正常對照者的水平。SLE患者外周靜脈全血中TNFα、TNFRs以及受體銜接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2mRNA的表達與正常對照者之間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義。與健康對照組相比，SLE患者CD4+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞比例顯著降低，而CD8+T淋巴細(xì)胞和CD14+CD64

7、+細(xì)胞比例顯著升高。SLE患者TNFR1+細(xì)胞的比例在CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞以及成熟單核細(xì)胞中與正常對照組無顯著差別，但在CD19+B淋巴細(xì)胞中顯著高于正常對照組。SLE患者TNFR2+細(xì)胞的比例在CD4+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞中顯著高于正常對照組，但在CD8+T淋巴細(xì)胞以及成熟單核細(xì)胞中與正常對照組無顯著差別。SLE患者和正常對照組間所有已分析的細(xì)胞亞群中TRADD+細(xì)胞的比例無顯著差別。SLE患者RIP+細(xì)胞的比例在

8、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞中顯著低于正常對照組，但在成熟單核細(xì)胞中的比例與正常對照組沒有明顯差別。SLE患者TRAF—2+細(xì)胞的比例在CD4+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞中顯著高于正常對照組，但在CD8+T淋巴細(xì)胞以及成熟單核細(xì)胞中與正常對照組比較無顯著差別。SLE患者活化的Caspase3+細(xì)胞的比例在CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞中均顯著高于正常對照組

9、。SLE患者血清TNFα水平與外周血淋巴細(xì)胞亞群中TNFRs、受體銜接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2的表達無明顯相關(guān)關(guān)系，也與狼瘡病變活動度SLEDAI無明顯相關(guān)關(guān)系。SLE患者CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞中TNFR1+細(xì)胞的比例與狼瘡病變活動度SLEDAI呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。SLE患者CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞中TNFR2+細(xì)胞的比例與狼瘡病變活動度SLEDAI呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。SLE患者不同淋

10、巴細(xì)胞亞群中受體銜接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2陽性細(xì)胞的比例與狼瘡病變活動度SLEDAI無明顯相關(guān)關(guān)系。 小結(jié)：SLE患者血清中TNFα的水平顯著升高。SLE患者CD19+B淋巴細(xì)胞中TNFR1+細(xì)胞的比例顯著上升，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞中TNFR2+細(xì)胞和TRAF—2+細(xì)胞的比例顯著上升。雖然在第一章的研究中顯示SLE患者PBMCs中TNFR2和TRAF—2mRNA水平表達低下，但本部分研究顯示CD

11、4+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞中TNFR2和TRAF—2的表達顯著上升，其差異機制可能與研究mRNA水平和蛋白水平之間存在差異有關(guān)。 第三章 TNFα信號通路主要受體銜接蛋白在狼瘡腎炎患者腎組織中的表達變化及其在SLE器官炎癥性病變中的作用 目的：探討TNFα信號通路主要受體銜接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2在狼瘡腎炎患者腎臟活檢組織中的表達變化及其在SLE器官炎癥性病變中的作用。 方法：收集LN患者

12、腎臟活檢組織標(biāo)本，以腎臟腫瘤切除術(shù)中遠(yuǎn)離腫瘤部位的正常腎組織為對照。腎臟組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，采用免疫組化染色方法檢測TNFα、TRADD、RIP和TRAF—2的表達。同時檢測反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志蛋白增殖細(xì)胞核抗原以及反映炎癥細(xì)胞浸潤情況的單核—巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD68的表達。分析TNFα、受體銜接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2的表達與PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和CD68陽性細(xì)胞數(shù)以及腎臟病理改變之間的相關(guān)性。 結(jié)果：19

13、例LN患者腎組織標(biāo)本及4例正常腎組織標(biāo)本免疫組化研究結(jié)果顯示：正常腎組織中未發(fā)現(xiàn)TNFα表達陽性信號，而在壁層上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、遠(yuǎn)端和近端腎小管中可見TRADD、RIP和TRAF—2少量表達。TNFα、TRADD、RIP和TRAF—2的表達增強與PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和CD68陽性細(xì)胞數(shù)的增多以及腎臟病變活動度的增加顯著正相關(guān)。 小結(jié)：TNFα和TNFα信號通路主要受體銜接蛋白在LN患者腎活檢組織中的異常表達可能通過介導(dǎo)

14、異常細(xì)胞增生和促炎癥信號參與LN局部組織器官的免疫病理損傷。 第四章 TRAF—2在免疫復(fù)合物誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞增殖中的作用 目的：探討TNFα信號通路受體銜接蛋白TRAF—2在免疫復(fù)合物誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞增殖中的作用。 方法：以聚合IgG,一種標(biāo)準(zhǔn)的免疫復(fù)合物模型刺激體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞株。依據(jù)設(shè)計小于擾RNA的原則，以TRAF—2為靶基因設(shè)計并合成siRNA

15、。實驗分對照組、無siRNA轉(zhuǎn)染+AIgG刺激組、對照siRNA轉(zhuǎn)染+AlgG刺激組、TRAF—2 siRNA轉(zhuǎn)染+AIgG刺激組。RT—PCR和Western blot法觀察大鼠腎小球系膜細(xì)胞中TRAF—2、IL-1β、IL—6表達改變，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化，Annexin V檢測凋亡細(xì)胞的改變。 結(jié)果：可溶性AIgG可呈時間梯度和濃度梯度依賴性刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞上調(diào)表達IL-1β和IL—6，

16、并刺激細(xì)胞增殖?？扇苄訟IgG可刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞上調(diào)表達TRAF—2。TRAF—2 siRNA轉(zhuǎn)染可抑制可溶性AIgG所誘導(dǎo)的TRAF—2的上調(diào)表達，并可抑制可溶性AIgG刺激所引起的IL-1β和IL—6的上調(diào)表達。TRAF—2 siRNA可將細(xì)胞阻滯在G1期，阻止細(xì)胞進入S期，并促進細(xì)胞凋亡。 小結(jié)：可溶性AIgG對大鼠腎小球系膜細(xì)胞具有時間梯度和濃度梯度依賴的促炎癥因子分泌和促細(xì)胞增殖作用。TRAF—2參與了可溶性Al

17、gG誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的促炎癥因子分泌和促細(xì)胞增殖作用。特異性地阻斷TRAF—2可顯著抑制可溶性AIgG誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的促炎癥因子分泌和促細(xì)胞增殖作用。在特定的組織器官中應(yīng)用siRNA阻斷TRAF—2可能是一種有效、高特異性且低毒性的治療LN的方法。 結(jié)論： TNFα信號通路中主要的受體銜接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2在SLE患者PBMCs、不同淋巴細(xì)胞亞群以及腎臟組織中的異常表達參與了TNFα