hu3D3-cSA介導(dǎo)的多藥物肺癌預(yù)靶向治療的初步研究.pdf

1、抗體介導(dǎo)的腫瘤靶向治療已經(jīng)成為抗腫瘤研究和臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)之一，但是傳統(tǒng)的以抗腫瘤單抗為載體直接偶聯(lián)效應(yīng)分子的靶向治療只能攜帶一種藥物，往往不能達(dá)到理想的治療效果，且免疫偶聯(lián)物分子量較大，藥物的組織穿透能力有限，從而限制了藥物的使用劑量和臨床應(yīng)用。為克服上述不足，本研究旨在以人源化的抗人肺癌單域抗體(hu3D3)為靶向載體，通過引入鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，構(gòu)建一種能同時(shí)將多種藥物攜帶至腫瘤部位的靶向通用載體，實(shí)現(xiàn)肺癌的預(yù)靶向多藥物聯(lián)合治療

2、。 PCR擴(kuò)增核心鏈霉親和素基因，克隆至質(zhì)粒hu3D3/pET-22b(+)，構(gòu)建表達(dá)載體hu3D3/cSA/pET-22b(+)，并轉(zhuǎn)化至E．coliBL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。鎳親和層析柱純化目的蛋白，采用透析和凝膠過濾層析的方法對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性。SDS-PAGE和Westernblot鑒定融合蛋白四聚體的形成。FITC標(biāo)記hu3D3/cSA后，熒光顯微鏡分析融合蛋白中hu3D3組分的抗原反應(yīng)性和特異性；流式細(xì)

3、胞術(shù)比較融合蛋白hu3D3/cSA和單域抗體hu3D3與靶抗原的結(jié)合能力。ELISA和Westernblot鑒定融合蛋白中cSA組分結(jié)合生物素的能力。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法觀測各實(shí)驗(yàn)組的A549細(xì)胞生長曲線，MTT法比較各藥物組對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表明，我們獲得了正確序列的hu3D3/cSA/pET22b(+)重組子，融合基因在E．coliBL21(DE3)中主要以包涵體的形式表達(dá)。純化復(fù)性后的融合蛋白能夠形成四聚體復(fù)合物，保留了c

4、SA結(jié)合生物素的活性，hu3D3組分能與肺癌細(xì)胞表面抗原結(jié)合，且結(jié)合能力比單域抗體hu3D3強(qiáng)6～9倍。生長曲線圖表明，hu3D3/cSA聯(lián)合生物素化藥物組比單純生物素化藥物組的細(xì)胞存活率低25％～30％；細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)顯示，與單純的生物素化藥物組相比，hu3D3/cSA介導(dǎo)的生物素化藥物組對(duì)靶細(xì)胞A549的殺傷率提高了25％～35％。 總之，我們通過基因工程技術(shù)成功表達(dá)了融合蛋白hu3D3/cSA，融合蛋白具有結(jié)合靶抗原和生物素