生物制品質量控制中殘留蛋白檢測方法的建立和應用.pdf

1、傳統(tǒng)的生物制品包括疫苗、抗血清、免疫應答產(chǎn)物、血液、血液制品及血液制品衍生物。隨著生物技術的進步，生物制品所包含的范圍較傳統(tǒng)定義有了很大程度的擴展，最主要的體現(xiàn)在現(xiàn)代生物制品的內(nèi)容包括了診斷和治療用的細胞因子和抗體、體細胞和基因以及人源和異源組織。由于生物制品大多數(shù)來源于活供體產(chǎn)生的有生物活性的合成物質，而這類物質又多是具有生物傳染源性質，所以在其生產(chǎn)、銷售及之后的處理過程中，要受到嚴密的評估和監(jiān)管，以其保證生物制品的安全性和有效性。這

2、些評估體系包括為達到生物制品的質量要求所采取的計劃、監(jiān)測及校正等作業(yè)技術和活動，即質量控制。質量控制主要包括原材料的生物安全性評估，生物制品純化過程的反應活性及殘留污染物檢測等。生物制品的殘留物質中的殘留蛋白包括真核宿主細胞蛋白、原核宿主細胞（如大腸桿菌）蛋白、雞胚來源蛋白、培養(yǎng)介質中血清蛋白成分（如牛血清白蛋白）等。在國外許多公司和研究機構采取多種方法來減少這些殘留蛋白成分從而進行質量控制，同時采取了高度敏感可靠的方法對這些質量控制的

3、結果實施檢測。近年，我國也對這些殘留蛋白在生物制品中殘留量的上限進行了規(guī)定，但是相關研究工作與國外比較相對滯后，現(xiàn)有許多檢測方法水平較低，難以滿足科研及市場發(fā)展需要。
　　本研究的第一部分采用大腸桿菌菌體蛋白免疫家兔，制備得到抗菌體蛋白兔多克隆抗體。應用飽和硫酸銨、陰離子交換柱層析和親和層析方法純化的兔抗大腸桿菌菌體蛋白多克隆抗體，純化后標記生物素，并經(jīng)親和素放大系統(tǒng)放大。在國內(nèi)首次建立了親和層析方法純化的兔抗大腸桿菌菌體蛋白多克

4、隆抗體檢測大腸桿菌菌體蛋白的ELISA方法，敏感性為0.32μg/L，檢測范圍在1-100μg/L，批內(nèi)CV小于7.7％，批間CV小于6.2％，具有良好的穩(wěn)定性，敏感性與檢測范圍與國際同類商品化檢測試劑盒接近。此外，本實驗還采用大腸桿菌菌體蛋白免疫小鼠并制備得到抗菌體蛋白小鼠的單克隆抗體33株。經(jīng)質譜分析鑒定出抗大腸桿菌菌體蛋白成分中分子伴侶GroEL的單克隆抗體，并且抗體可以用來通過免疫沉淀的方法，從大腸桿菌菌體蛋白中分離出這一分子，

5、為進一步研究分子伴侶GroEL的結構和功能提供了新的手段。
　　本研究第二部分是以牛血清白蛋白免疫小鼠，用含有馬血清的培養(yǎng)基制備得到抗牛血清白蛋白的小鼠單克隆抗體11株，經(jīng)飽和硫酸銨和陰離子交換層析純化后標記辣根過氧化物酶（HRP），通過夾心配對ELISA法篩選出夾心ELISA最佳包被和檢測抗體，在國內(nèi)首先建立了以單克隆抗體檢測牛血清白蛋白的夾心ELISA方法，敏感性為0.38μg/L，檢測范圍在0.5-40μg/L，批內(nèi)和批間變

6、異系數(shù)均小于10％。采用這一方法檢測牛血清白蛋白，比國外單克隆抗體試劑盒敏感高10倍，與國外多克隆抗體試劑盒相當。
　　總之，本研究成功制備了抗牛血清白蛋白的單克隆抗體和抗大腸桿菌菌體蛋白多克隆抗體，建立了檢測牛血清白蛋白的基于單克隆抗體的夾心ELISA方法和檢測大腸桿菌菌體蛋白的親和層析多克隆抗體夾心ELISA方法，鑒定了大腸桿菌菌體蛋白成分GroEL單克隆抗體的部分用途，為進一步檢測生物制品中殘留蛋白的質量控制和相關研究打下扎