應(yīng)用PCR法檢測(cè)生物制品中支原體污染.pdf

1、支原體(Mycoplasma)是一類缺乏細(xì)胞壁的最小原核細(xì)胞型微生物，它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大小介于病毒和細(xì)菌之間。自1956年第一次檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)物中存在支原體污染以來(lái)，支原體污染細(xì)胞培養(yǎng)物這個(gè)世界性問(wèn)題持續(xù)了半個(gè)多世紀(jì)，獸用活疫苗中存在支原體污染的事例同樣屢見(jiàn)不鮮，嚴(yán)重影響了疫苗的純凈性，降低疫苗的質(zhì)量進(jìn)而引發(fā)支原體感染，給畜牧業(yè)及疫苗生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了預(yù)防及控制支原體污染，減少支原體污染帶來(lái)的危害，各種檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用到支原體污

2、染的檢測(cè)領(lǐng)域中，各國(guó)相繼建立了支原體的檢測(cè)方法。我國(guó)對(duì)支原體污染的研究工作起步較晚，支原體污染的檢測(cè)技術(shù)有待改進(jìn)。
　　 為了完善生物制品中支原體污染的檢測(cè)技術(shù)，本研究針對(duì)口腔支原體(Ora)、精氨酸支原體(Arg)、發(fā)酵支原體(Fer)、萊氏無(wú)膽甾原體(Ala)、豬鼻支原體(Mho)、豬肺炎支原體(Mhp)、雞毒支原體(Mg)、牛支原體(Mbo)、衣阿華支原體(Mi)、滑液支原體(Ms)、絮狀支原體(Mf)、火雞支原體(Mm)

3、、雞支原體(Gal)、鴨支原體(Ma)，共計(jì)14種污染生物制品的常見(jiàn)支原體設(shè)計(jì)引物，建立PCR檢測(cè)方法，并應(yīng)用此方法對(duì)多種生物制品進(jìn)行檢測(cè)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.生物制品中支原體污染的PCR檢測(cè)方法的建立對(duì)14種支原體標(biāo)準(zhǔn)株的基因組序列進(jìn)行分析，自行設(shè)計(jì)出一對(duì)可以檢測(cè)這14種支原體的通用引物，同時(shí)培養(yǎng)這14種支原體，獲取DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示14個(gè)模板均有目的片段，且片段大小在440bp～467bp之間

4、，以此建立生物制品中支原體污染的PCR檢測(cè)方法，擴(kuò)大污染生物制品的支原體檢測(cè)范圍。
　　 2.生物制品中支原體污染的PCR檢測(cè)方法的敏感性及特異性試驗(yàn)使用顏色變化單位法（CCU法）檢測(cè)出8種支原體培養(yǎng)物的濃度后，對(duì)已建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，此方法可以檢測(cè)到8種支原體的最小濃度在1CCU～10CCU之間;在特異性試驗(yàn)中，選取各類細(xì)菌及病毒14種作對(duì)照，結(jié)果14種對(duì)照均不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明此PCR檢測(cè)方

5、法敏感性良好，特異性強(qiáng)。
　　 3.生物制品中支原體污染的PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用應(yīng)用此方法對(duì)10種獸用活疫苗中71個(gè)批次的樣品和11種細(xì)胞系的24份傳代細(xì)胞樣品進(jìn)行支原體污染檢測(cè)，結(jié)果有3份疫苗樣品為陽(yáng)性、6份細(xì)胞樣品為陽(yáng)性。在對(duì)比其他支原體污染的檢測(cè)方法中，已建立的PCR檢測(cè)方法與培養(yǎng)法、DNA熒光染色法的檢測(cè)結(jié)果均相同，但商品化支原體PCR檢測(cè)試劑盒主要針對(duì)污染細(xì)胞的5種支原體有擴(kuò)增反應(yīng)，其檢測(cè)結(jié)果是2份疫苗樣品為陽(yáng)性、6份細(xì)