生物制品制造新技術(shù)

1、教學(xué)目的與要求,掌握基因工程疫苗的原理，了解基因工程疫苗的概念與進(jìn)展。了解生物技術(shù)診斷制劑，掌握這些生物技術(shù)診斷制劑的原理了解抗體工程的種類(lèi)。,Introduction疫苗技術(shù)的3個(gè)階段：第一次革命：經(jīng)典的微生物疫苗時(shí)代：19世紀(jì)到20世紀(jì)第二次革命：20世紀(jì)70年代生物技術(shù)的出現(xiàn)：重組DNA技術(shù)為代表的基因工程疫苗時(shí)代第三次革命：20世紀(jì)90年代的DNA疫苗時(shí)代,重組DNA技術(shù)產(chǎn)生基因工程疫苗：重組亞單位疫

2、苗、活載體疫苗、基因缺失疫苗和DNA疫苗等疫苗；生物技術(shù)診斷抗原制劑，如基因工程抗原、核酸探針、PCR和基因芯片等的制造新技術(shù)，抗體工程技術(shù)。治療性疫苗、腫瘤疫苗和生理調(diào)控疫苗等。反向遺傳學(xué)疫苗研制途徑。,第一節(jié)、基因工程疫苗 基因工程疫苗：指用重組DNA技術(shù)研制的疫苗。重組亞單位疫苗、活載體苗、基因缺失疫苗，裸露DNA疫苗等。新途徑，新希望，受到重視。,一、重組亞單位疫苗（recombinant subuni

3、t vaccines) 用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)朐嘶蛘婧思?xì)胞，使其在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原肽鏈，加入佐劑即制成生物制品，叫基因工程重組亞單位疫苗。,原 理,,選擇合適的表達(dá)系統(tǒng),PCR擴(kuò)增保護(hù)性抗原的基因,重組DNA：把抗原的基因亞克隆到表達(dá)載體,重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)的宿主細(xì)胞,鑒定和選擇表達(dá)所需細(xì)胞,培養(yǎng)繁殖,制備疫苗,,,,,,,生產(chǎn)重組亞單位疫苗

4、的表達(dá)系統(tǒng)：原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸埃希氏菌（E. coli）和枯草桿菌（Bacillus subtilis）表達(dá)系統(tǒng)。（最常用），其他如：鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)等真核表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系統(tǒng)；昆蟲(chóng)基因表達(dá)系統(tǒng)；絲狀真菌基因表達(dá)系統(tǒng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物表達(dá)系統(tǒng)參考：基因工程原理。,重組亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)：安全性好，無(wú)感染，可用于不宜使用活疫苗動(dòng)物，如妊娠動(dòng)物。減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以避免的熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原和其它

5、有害的反應(yīng)原。穩(wěn)定性好，便于保存和運(yùn)輸，可與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，適合疫病的控制和消滅計(jì)劃。,成功例案：首次：口蹄疫基因工程亞單位疫苗；人乙型肝炎基因工程亞單位疫苗，廣泛應(yīng)用。預(yù)防仔豬和犢牛下痢的大腸桿菌菌毛基因工程重組亞單位疫苗。,二、重組活載體疫苗（live, vectored vaccines)定義：用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因（目的基因）轉(zhuǎn)移到載體中使之表達(dá)的活疫苗。分類(lèi)：重組載體病毒活疫苗、重組載體細(xì)菌活疫苗

6、細(xì)菌載體，沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等；病毒載體：痘病毒，腺病毒和皰疹病毒等。例子：國(guó)外：腺病毒為載體的乙肝疫苗、以皰疹病毒為載體的新城疫疫苗等。優(yōu)點(diǎn)：活載體疫苗具有傳統(tǒng)疫苗的許多優(yōu)點(diǎn)，而且又為多價(jià)苗和聯(lián)苗的生產(chǎn)開(kāi)辟了新路，是當(dāng)今與未來(lái)疫苗研制與開(kāi)發(fā)的主要方向之一。,(非復(fù)制性疫苗，又稱(chēng)活-死疫苗：與重組活載體疫苗類(lèi)似，但載體病毒接種后只產(chǎn)生頓挫感染，不能完成復(fù)制過(guò)程，無(wú)排毒的隱患，同時(shí)又可表達(dá)目的抗原，產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。如用金絲雀

7、痘病毒為載體，表達(dá)新城疫病毒HF基因，用于預(yù)防雞的新城疫。),重組活載體主要包括病毒、細(xì)菌，詳見(jiàn)表5.1。,,（一）重組載體病毒活疫苗 病毒載體兩種：A：復(fù)制缺陷性載體病毒，只有通過(guò)特定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的互補(bǔ)作用或通過(guò)輔助病毒疊加感染才能產(chǎn)生傳染性后代；B：具有復(fù)制能力的病毒，如皰疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作為外源基因的載體而保持其傳染性。,例子： 利用雞痘病毒為載體，國(guó)內(nèi)外已成功表達(dá)了流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒

8、、馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、狂犬病病毒、傳染性支氣管炎病毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美爾球蟲(chóng)等的保護(hù)性抗原基因，其中部分產(chǎn)品已正式注冊(cè)。圖5.1概括了重組病毒活載體構(gòu)建策略與原理。,,,（二）重組載體細(xì)菌活疫苗 優(yōu)點(diǎn)：細(xì)菌載體本身起佐劑作用，刺激產(chǎn)生強(qiáng)的B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答?？诜抽T(mén)氏菌疫苗還能刺激黏膜免疫，如把志賀氏菌、霍亂弧菌和大腸埃希氏菌的抗原基因?qū)肷抽T(mén)氏菌表達(dá)。研究少，涉及細(xì)菌多基因，較困

9、難，如 細(xì)菌外膜其他結(jié)構(gòu)：黏附分子侵襲蛋白和鞭毛脂多糖等復(fù)雜 ，如 LPS表達(dá)涉及30多個(gè)基因的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。代表 ：疫苗株沙門(mén)氏菌、李斯特氏菌和卡介苗、痢疾菌等。,三、基因缺失疫苗（gene deleted vaccines)定義：用基因工程技術(shù)將強(qiáng)毒株毒力相關(guān)基因切除構(gòu)建的活疫苗。該 技術(shù)策略如下圖,基因缺失疫苗優(yōu)點(diǎn)：安全性好、不易返祖；免疫力堅(jiān)實(shí)，免疫期長(zhǎng)，適于局部接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫力。例子：如霍亂弧菌苗；大腸

10、桿菌苗；偽狂犬病毒基因缺失疫苗,四、基因疫苗（genetic vaccines) 包括DNA疫苗和RNA疫苗，由編碼能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的基因片段和載體構(gòu)建而成。 基因疫苗研制的基本步驟是：①目的基因的分析；②選擇合適的表達(dá)載體；③測(cè)序確認(rèn)編碼序列；④體外轉(zhuǎn)錄／翻譯驗(yàn)證試驗(yàn)；⑤動(dòng)物試驗(yàn)；⑥結(jié)果評(píng)價(jià)等。 顧慮:是否與細(xì)胞染色體組整合，抗DNA免疫反應(yīng)的可能影響；免疫耐受；免疫效力如何進(jìn)一步提高等。,五、多肽

11、疫苗（peptide vaccines)定義：用化學(xué)合成法或基因工程手段合成病原微生物的保護(hù)性多肽或表位并將其連接到大分子載體上，再加入佐劑制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：可在同一載體上連接多種保護(hù)性肽鏈或多個(gè)血清型的保護(hù)性抗原肽鏈，一次免疫就可防幾種傳染病。例子：最早報(bào)道（1982)成功的是口蹄疫多肽疫苗，還有乙型肝炎和瘧疾合成肽疫苗。,六、轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenic plant vaccine) 又稱(chēng)為食用疫

12、苗（edible vaccine） 兩種表達(dá)系統(tǒng)：整合表達(dá)系統(tǒng)，把編碼病原體保護(hù)性抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，并整合到植物細(xì)胞染色體上，整合了外源基因的植物細(xì)胞在一定條件下生長(zhǎng)成新的植株。這些植株在生長(zhǎng)過(guò)程中可表達(dá)出疫苗抗原，并把這種性狀遺傳給子代，形成表達(dá)疫苗的植物品系。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，利用重組植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原的基因插入植物病毒基因組中，再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復(fù)制、裝配并高效表達(dá)。,第二節(jié)、生物

13、技術(shù)診斷制劑包括：1、重組表達(dá)抗原(recombinant antigen)2、核酸探針（nucleic acid probe, gene probe）、3、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）4、基因芯片（DNA chip）等。 特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，可獲得常規(guī)方法無(wú)法制備的一些診斷制劑，易于標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化。,一、重組表達(dá)抗原重組表達(dá)抗原：是用DNA重組技術(shù)，將編碼特定抗原的基因插入

14、原核或真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中使其高效表達(dá)，分離純化產(chǎn)物制造成重組表達(dá)抗原。優(yōu)點(diǎn)：高特異性、高純度、均質(zhì)性好、重復(fù)性強(qiáng)、成本較低，可大批量生產(chǎn)等；可獲得常規(guī)方法無(wú)法制備的診斷抗原；也可以獲得對(duì)人獸共患病特別是高危險(xiǎn)病原體（如免疫缺陷病毒、結(jié)核分枝桿菌、炭疽桿菌等）的診斷抗原。例子：已制備出標(biāo)準(zhǔn)的乙型肝炎各組分診斷抗原。發(fā)展前景看好。,二、核酸圖譜分析,（一）核酸電泳圖譜分析指分離純化的核酸，因其相對(duì)分子質(zhì)量的差異而在電泳中具

15、有不同的遷移速率并形成不同的帶型。通過(guò)帶型異同度的分析可確定生物體間的遺傳關(guān)系（兩種） 1．質(zhì)粒圖譜分析：質(zhì)粒是耐藥性、毒力因子等特殊遺傳特性的載體。多數(shù)細(xì)菌往往含有大小和數(shù)量不等的質(zhì)粒，具有相對(duì)穩(wěn)定性，質(zhì)粒圖譜分析是細(xì)菌分型和流行病學(xué)調(diào)查的重要工具，具有診斷價(jià)值。 優(yōu)點(diǎn)：該法簡(jiǎn)便、特異、快速、可靠， 缺點(diǎn)：對(duì)一些無(wú)質(zhì)?；蛸|(zhì)粒不穩(wěn)定的菌株，以及質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量相同而核苷酸序列不同的菌株無(wú)分辨能力。,2 .

16、RNA電泳圖譜分析：分節(jié)段RNA病毒的電泳圖譜分析常用。根據(jù)不同RNA片段相對(duì)分子質(zhì)量具有一定差異，在PAGE電泳中的遷移速率有所不同，染色后顯示出不同的電泳圖譜，因而可對(duì)不同的病毒或相同病毒不同毒株的基因組加以分析比較。,（二）核酸酶切圖譜分析生物的cDNA，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶切割產(chǎn)生的不同片段，瓊脂糖電泳后可形成不同的帶型，即核酸酶切圖譜，又稱(chēng)DNA指紋圖譜。用相同的限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA所產(chǎn)生片段的異同程度，直接反映生物體間

17、的遺傳關(guān)系。用不同的限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA可分析基因間的連鎖關(guān)系。用于比較不同病原體基因組的差異，了解它們之間遺傳關(guān)系。限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（RFLP）是其中一種。,（三）寡核苷酸指紋圖譜分析 將純化的RNA經(jīng)一種特殊的RNA酶（通常為T(mén)1酶）消化后，產(chǎn)生許多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠雙相電泳分離后進(jìn)行放射自顯影，形成一類(lèi)似指紋的圖譜，即寡核苷酸指紋圖譜。 用于 RNA病毒的研究，如基因

18、組遺傳多樣性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、歷史演變和宿主類(lèi)群關(guān)系的研究，野毒株與疫苗株的比較等。,三、核酸探針： 放射性同位素、地高辛或生物素等標(biāo)記核酸分子或其片段的一條鏈作為核酸探針，與處理樣本中存在的互補(bǔ)鏈結(jié)合為雙鏈，這個(gè)反應(yīng)就稱(chēng)為核酸雜交或分子雜交。分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交。根據(jù)方法不同，又分為原位雜交和轉(zhuǎn)印雜交。在轉(zhuǎn)印雜交中，檢測(cè)DNA的稱(chēng)為Southern雜交，檢測(cè)RNA稱(chēng)為N

19、orthern雜交。廣泛用于特定基因的檢測(cè)和基因轉(zhuǎn)錄活性的研究。,四、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR ) PCR技術(shù)是簡(jiǎn)便、一快速、特異、敏感的檢測(cè)手段，適于檢測(cè)不宜分離培養(yǎng)或含量極微的樣品中病原體，或分析不同樣品中基因片段的異同。PCR與酶切圖譜分析和分子雜交技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可獲得更好的效果。種類(lèi)：如（RT-PCR) 、熒光PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR等。,五、基因芯片DNA芯片（DNA chip), DNA微陣列（DN

20、A microarray)、寡核苷酸微芯片（oligonucleotide microchip)指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品中的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)。,20世紀(jì)90年代初，美國(guó)Fodor博士提出并研究。用于基因表達(dá)譜分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因突變與多態(tài)性分析、基因

21、組文庫(kù)作圖、疾病的診斷與預(yù)測(cè)、藥物篩選，以及司法與刑偵、環(huán)境與食品衛(wèi)生監(jiān)督等。六、其它技術(shù)核苷酸序列分析、多位點(diǎn)酶電泳等。,第三節(jié)、抗體工程技術(shù)多克隆抗體(Polyclonal antibody)一. 概念 給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物, 它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的, 稱(chēng)為多克隆抗體。,二. 多克隆抗體的應(yīng)用 免疫學(xué)檢測(cè) 被動(dòng)免疫治療和緊

22、急預(yù)防三.存在問(wèn)題 特異性差, 用于免疫學(xué)檢測(cè)容易出現(xiàn)交叉反應(yīng),單克隆抗體(Monoclonal antibody,McAb) 一、單抗概念: 通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。 二、B細(xì)胞雜交瘤的類(lèi)型 小鼠-小鼠 大鼠-大鼠 小鼠-人 人-人 1975年Kohler和Milstein建立體外淋巴

23、細(xì)胞雜交瘤技術(shù)， 1984年獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 。,三、單抗與多抗區(qū)別 如圖：5.2。,,四、單抗的制備（一）淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)：（lymphocyte hybridoma technology)。將經(jīng)預(yù)定抗原免疫的淋巴細(xì)胞與失去次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶(TK）合成能力的骨髓瘤細(xì)胞系細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、篩選或克隆化，獲得既能分泌針對(duì)預(yù)定抗原的單抗又有無(wú)限制增殖能力的

24、雜交瘤細(xì)胞系。,（二）雜交瘤技術(shù)的原理 1.親本細(xì)胞的選擇 小鼠骨髓瘤細(xì)胞:次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT) 缺陷型 免疫脾細(xì)胞:來(lái)自經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟（B細(xì)胞）,2. 細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞

25、 脾細(xì)胞融合后細(xì)胞的類(lèi)型: 未融合的脾細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 未融合的瘤細(xì)胞,,3 雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) DNA合成的途徑： 糖+氨基酸 氨基喋呤

26、 (Aminopterin,A) TK 核苷酸 DNA 胸腺嘧啶核苷 TMP (Thymidine,T) 核苷酸前體 HGPRT 次黃嘌呤

27、 IMP (Hypoxanthine, H),,,,,,,,,,,融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞（ HGPRT+, TK+, 不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)）骨髓瘤細(xì)胞（ HGPRT-, TK-，不能生長(zhǎng) ）雜交瘤細(xì)胞（ HGPRT+, TK+ ，能夠生長(zhǎng)）,4. 雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化 篩選： 免疫熒光 ELISA等 克隆化：

28、有限稀釋法 單個(gè)細(xì)胞顯微操作法 軟瓊脂培養(yǎng)法,5. 單克隆抗體的生產(chǎn) 體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水 體外：無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等6. 單克隆抗體的純化 硫酸銨沉淀法 離子交換層析 A蛋白-Sepharose親和層析,（三）操作步驟見(jiàn)下圖：,,1. B細(xì)胞的制備： 純Ag免疫小鼠2-3次，間隔2-4周，最后一次免疫結(jié)

29、束后3-4天取其脾臟，制成108/mL的脾細(xì)胞懸液。 2．骨髓瘤細(xì)胞的制備： 小鼠骨髓瘤細(xì)胞，如SP2/0或NS-1 具有營(yíng)養(yǎng)缺陷（缺少次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶），不能在HAT培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 在10％新生犢牛血清的DMEM中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)達(dá)105-106/mL，即可。,3．飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備小鼠胸腺細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作用：減少培養(yǎng)板對(duì)雜交瘤細(xì)胞的毒性，清除一部分死亡的細(xì)胞。在融合前，將飼

30、養(yǎng)細(xì)胞制成所需的濃度加入培養(yǎng)孔中。,4. HAT選擇培養(yǎng)基,H：次黃嘌呤(hypoxanthine), T：胸腺嘧啶核苷(thymidine)，T、H是DNA旁路合成途徑的原料； A：氨基喋吟( aminopterin )，DNA合成阻斷劑。 在HAT培養(yǎng)基，未融合的骨髓瘤細(xì)胞不能生長(zhǎng)； 未融合的脾細(xì)胞則在2周內(nèi)自然死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。 （見(jiàn)：HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞示意圖）,,HAT培養(yǎng)基篩選

31、原理,H, 次黃嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶,,A,(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ( HGPRT ),胸腺嘧啶激酶 ( TK )(Thymidine kinase),B淋巴細(xì)胞： HGPRT+， TK+骨髓瘤細(xì)胞： HGPRT-， TK-雜交瘤細(xì)胞： HGPRT+， TK+,存活（不可長(zhǎng)期存活）,死亡,外源性途徑(旁路

32、途徑),,,,存活,5．細(xì)胞融合1）將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以10:1-1:1混合，2）離心棄上清，然后緩慢加融合劑50％聚乙二醇(PEG 4000),3）靜置90S，漸加入HAT培養(yǎng)基，4）分裝培養(yǎng)：分別加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板孔中，置5％-10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 5d后更換1/2 HAT培養(yǎng)基，第10d改用HT培養(yǎng)基，第15d用完全DMEM培養(yǎng)基。 細(xì)胞融合的常用試劑及其配制方法參見(jiàn)表5.3,,,6．雜交

33、瘤細(xì)胞篩選 應(yīng)用ELISA、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)檢測(cè)各孔中的抗體，篩選陽(yáng)性孔。7．雜交瘤細(xì)胞的克隆化 雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性孔，盡早克隆化。（保證單個(gè)克隆，防止染色體丟失，而喪失分泌抗體的能力 ）,克隆3-5次使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定?？寺』姆椒ㄈ缦拢?(1)有限稀釋法: 將陽(yáng)性孔的細(xì)胞稀釋成5-10個(gè)細(xì)胞/ml，加入96孔培養(yǎng)板，0.l ml/孔，每孔約含一個(gè)細(xì)胞，每天用倒置顯微鏡觀(guān)察確證是一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。 (2)顯微操作法：用有直

34、角彎頭的毛細(xì)吸管，在倒置顯微鏡下將分散在培養(yǎng)皿上的單個(gè)細(xì)胞吸入管內(nèi)，移種到培養(yǎng)板中，即可獲得單個(gè)細(xì)胞形成的克隆。,(3)軟瓊脂平板法： 在45℃水浴中，將飼養(yǎng)細(xì)胞與0.5％瓊脂糖（用DMEM配制）混合，倒入培養(yǎng)皿凝固后作為底層，后將陽(yáng)性孔細(xì)胞懸于預(yù)熱至45℃的培養(yǎng)基中與等量0.5％瓊脂糖混合，再加于平皿內(nèi)，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)1-2周后可見(jiàn)小白點(diǎn)，即為一個(gè)克隆，自軟瓊脂上吸出移入培養(yǎng)板中培養(yǎng)即得單個(gè)克隆的雜交瘤細(xì)胞。,8．雜交瘤細(xì)胞的凍

35、存 原始克隆、克隆化后的雜交瘤細(xì)胞，加DMSO，分裝于小安瓶?jī)?nèi)保存于液氮中。9．單抗的生產(chǎn)方法 (1)動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水； (2)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)：無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等。10. 單克隆抗體的純化 硫酸銨沉淀法 離子交換層析 A蛋白-Sepharose親和層析,（一）用作診斷試劑 1. 檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子，區(qū)分不

36、同分化階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。 2. 鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。 3. 用于腫瘤的診斷和分型 4. 激素類(lèi)單抗用于測(cè)定體內(nèi)激素含量，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài),五、單克隆抗體的應(yīng)用（醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用）,（二）用作研究工具純化抗原分析和探查抗原結(jié)構(gòu)分析抗原決定簇分子的功能（三）用于疾病的治療抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療,單克隆抗體用于免

37、疫治療存在的問(wèn)題單克隆抗體的特異性 由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對(duì)腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對(duì)正常組織有交叉反應(yīng)異種抗體反應(yīng) 鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng),一、概念： 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。,基因工程抗體(Genetic engineering antibody),二、制備過(guò)程： a、獲

38、得抗體基因片段b、將抗體基因片段導(dǎo)入真核細(xì)胞（如雜交瘤細(xì)胞）或原核細(xì)胞（如大腸桿菌），使之表達(dá)有免疫活性的抗體片段。主要包括 ：嵌合抗體、單鏈抗體、重構(gòu)抗體、人源化抗體、 Ig相關(guān)分子、噬菌體抗體、（抗體文庫(kù)。）,三、幾種重要的抗體（一）嵌合抗體（chimeric antibody)指在同一抗體分子中含有不同種屬來(lái)源抗體片段的抗體，又稱(chēng)雜種抗體。多為“鼠-人”類(lèi)型，既抗體的Fab或F(ab)2來(lái)源于鼠類(lèi)，而Fc片段來(lái)源于人類(lèi)。

39、減少了抗體中的鼠源性成分。,（二）重構(gòu)抗體（reshaping antibody)將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab骨架區(qū)的編碼基因中，再將此DNA片段與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合的V區(qū)抗體。（即在人抗體可變區(qū)序列內(nèi)嵌入鼠源抗體的高變區(qū)基因序列）,（三）單鏈抗體（single-chain antibody) 即FV分子或單鏈抗體蛋白：由VL區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)肽連接物（l

40、inker）連接而成。（此外肽連接物還可將藥物、毒素或同位素與單鏈抗體蛋白相融合。） 相對(duì)分子質(zhì)量小，作為外源性蛋白的免疫原性較低；在血清中比完整的單克隆抗體或F (ab) 2片段能更快地被清除；無(wú)Fc片段，體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可避免非特異性殺傷；能進(jìn)入實(shí)體瘤周?chē)奈⒀h(huán)等優(yōu)點(diǎn)。,（四）Ig相關(guān)分子將抗體分子的部分片段（如V區(qū)或C區(qū)）連接到與抗體無(wú)關(guān)的序列上（如毒素），制成Ig相關(guān)分子。例如將有治療作用的毒素或化療藥物取代抗體的F

41、c片段，通過(guò)高變區(qū)結(jié)合特異性抗原，連接上的毒素可直接運(yùn)送到靶細(xì)胞表面，起“生物導(dǎo)彈”的作用。Byrn的“CD4免疫黏附素” 將CD4基因與IgG1 C區(qū)在體外重組而表達(dá)出的Ig相關(guān)分子，可封閉人HIV gp120蛋白與CD4+T細(xì)胞的結(jié)合，治療艾滋病上具有潛在價(jià)值。,（五）噬菌體抗體 （phage antibody)將已知特異性的抗體分子的所有V區(qū)基因在噬菌體中構(gòu)建成基因庫(kù)，用噬菌體感染細(xì)菌，模擬免疫選擇過(guò)程，具有相應(yīng)特異性的重

42、鏈和輕鏈可變區(qū)即可在噬菌體表面呈現(xiàn)出來(lái)。即噬菌體表面展示技術(shù)（phage display technology)。,（六）全套抗體（the immunoglobulin repertoire）基因庫(kù)即抗體基因文庫(kù)。從構(gòu)建的人和動(dòng)物抗體基因總文庫(kù)中篩選和表達(dá)針對(duì)任一抗原的抗體基因，將結(jié)束僅依靠免疫獲得抗體的狀況。,催化抗體（catalytic antibody) 一 、概念: 也叫抗體酶（abzyme)，是具有催化活性的免