泥鰍腸道益生菌的篩選及應(yīng)用研究.pdf

1、本文對(duì)泥鰍幼魚和成魚腸道菌群多樣性進(jìn)行分析，并從中篩選出在體外能產(chǎn)多種酶以及對(duì)常見(jiàn)致病菌有較強(qiáng)拮抗作用的潛在益生菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），并且評(píng)估投喂對(duì)泥鰍幼魚生長(zhǎng)、消化酶和非特異性免疫的影響，以期為益生菌在泥鰍配合飼料中的應(yīng)用提供參考。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴運(yùn)用高通量測(cè)序方法研究健康泥鰍成魚和幼魚腸道菌群組成。試驗(yàn)分為3組，馴化幼魚組（C1）、野生幼魚組（N1）和野生成魚組（N2）。提取腸道基因

2、組DNA，PCR擴(kuò)增16SrRNA基因V3-V4片段，采用Illumina公司的Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。在門水平上，在泥鰍馴養(yǎng)幼魚(C1）和野生幼魚（N1)中變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，分別為整個(gè)菌群的91.3％、94.4%，厚壁菌門為次優(yōu)勢(shì)菌群，分別占8.5%、4.0%；在野生泥鰍成魚（N2）中，變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)占79.6%，梭桿菌門為次優(yōu)勢(shì)菌群占18.4%。在屬水平上，馴養(yǎng)組幼魚（C1）腸道菌群有14個(gè)屬，其中氣單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬占

3、整個(gè)腸道菌群的84.4%；野生幼魚（N1）腸道菌群有17個(gè)屬依次其中不動(dòng)桿菌屬和氣單胞菌屬占整個(gè)腸道菌群的90.2%。野生成魚（N2）腸道菌群有24個(gè)屬，其中氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和鯨桿菌屬占整個(gè)腸道菌群的89.3%。⑵將從野生泥鰍幼魚和成魚腸道分離的93株細(xì)菌進(jìn)行體外產(chǎn)酶試驗(yàn)和對(duì)常見(jiàn)水生動(dòng)物病原菌（嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、副溶血弧菌和腐敗希瓦氏菌）的拮抗試驗(yàn)，得到6株能產(chǎn)3種酶（淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶）的菌株和2株有拮抗活性的菌株

4、，再通過(guò)溶血性試驗(yàn)篩選出3株無(wú)溶血活性的菌株分別為N1-08、N2-08和N2-26菌株。選擇同時(shí)具有拮抗活性和產(chǎn)酶活性的N1-08菌株，進(jìn)行安全性試驗(yàn)，將菌懸液（109 cells/mL）通過(guò)腹腔注射泥鰍幼魚，每尾200μL。結(jié)果表明，該菌株對(duì)泥鰍幼魚均無(wú)致病性。16S rRNA序列分析表明，N1-08菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，AB735994）相似。⑶以基礎(chǔ)餌料為對(duì)照組（C），在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行為期4周