Survivin啟動子調(diào)控SEA-PNP融合基因抗肺癌的實驗研究.pdf

1、目的： 本研究首先以腫瘤特異性啟動子替換pEGFP-C1載體中的CMV啟動子，構(gòu)建攜帶Survivin啟動子的真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1/Surp，分別轉(zhuǎn)染肺癌A549及人胚成纖維細胞MRC-5比較其腫瘤特異性；以基因SOEing法擴增sea-pnp融合基因，構(gòu)建pSGFP-SEA-PNP真核表達質(zhì)粒；通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細胞中的特異性表達；通過PBMC刺激實驗以MTT法檢測表達產(chǎn)物的超抗原活性；以MTT法檢

2、測重組質(zhì)粒在A549細胞中的表達產(chǎn)物將低毒的氟阿糖腺苷.磷酸（F-ara-AMP，fludarabine，氟達拉濱）轉(zhuǎn)化為高毒性2-氟腺嘌呤（2-F-adeninie，2-F-A）的細胞毒作用。本研究旨在為探索肺癌及其它腫瘤的靶向基因治療途徑及機理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.用PCR法和基因克隆技術(shù)在真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1基礎(chǔ)上構(gòu)建Survivin啟動子調(diào)控的、以綠色熒光蛋白為目的基因的真核表達質(zhì)粒pSGFP（pEGF

3、P-C1/Surp）。 2.將該重組質(zhì)粒和pEGFP-C1分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肺腺癌細胞（A549）和人胚肺成纖維細胞（MRC-5），72h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，并用Imagepro-Plus6.0分析Survivin啟動子在肺癌細胞內(nèi)特異啟動綠色熒光蛋白的表達水平。 3.以ATCC25923金黃色葡萄球菌基因組為模板，PCR擴增sea基因，以JM109大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增PNP基因，然后以S

4、OEing法構(gòu)建sea-pnp融合基因。以pSGFP為基礎(chǔ)，構(gòu)建pSGFP-SEA-PNP真核表達質(zhì)粒；用脂質(zhì)體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，72h后提取總RNA，通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細胞中的特異性表達。 4.用脂質(zhì)體將pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，72h后，收集細胞培養(yǎng)的上清液和轉(zhuǎn)染細胞裂解液。制備健康獻血者PBMC，用上清液和細胞裂解液進行PBMC刺激實驗，用MTT法、通過比較刺激指數(shù)以檢測其

5、促細胞增殖效應(yīng)。 5.用脂質(zhì)體將pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，36h后，更換有效濃度的氟阿糖腺苷-磷酸（F-ara-AMP，fludarabine，氟達拉濱）培養(yǎng)液，MTT法檢測其殺瘤效應(yīng)。 結(jié)果： 1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實pSGFP（pEGFP-C1/Surp）真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功；將重組質(zhì)粒及pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染A549細胞和MRC-5細胞72h后，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的A549

6、細胞中觀察到了綠色熒光蛋白的表達，而在MRC-5細胞中無綠色熒光蛋白表達；在轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的兩種細胞中均觀察到綠色熒光蛋白的表達。經(jīng)Imagepro-Plus6.0分析，在A549細胞中Survivin啟動子啟動活性約為CMV啟動子活性的65.15％。 2.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實pSGFP-SEA-PNP真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞后，RT-PCR結(jié)果表明，pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒在A549

7、細胞中成功表達了sea-pnp目的基因。 3.經(jīng)MTT實驗結(jié)果證實，pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞的裂解液具有促進人PBMC增殖活性、上清液無明顯促PBMC增殖作用；裂解液實驗組、上清液實驗組和PHA陽性對照組的刺激指數(shù)分別為1.290、0.855和1.637。 4.經(jīng)MTT實驗結(jié)果證實，經(jīng)pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞后所表達的產(chǎn)物能將F-ara-AMP轉(zhuǎn)化形成高毒性2-F-A，對A54

8、9細胞有一定殺傷作用。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了腫瘤特異性啟動子Survivin調(diào)控的、以綠色熒光蛋白為目的基因的真核表達質(zhì)粒，該啟動子表現(xiàn)出腫瘤特異性，且在肺癌A549細胞中具有較好的啟動效應(yīng)。 2.成功構(gòu)建Survivin啟動子調(diào)控的、以sea-pnp融合基因為目的基因的真核表達質(zhì)粒pSGFP-SEA-PNP，并在A549細胞中啟動了sea-pnp基因的表達。 3.pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒在A54