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1、在酵母中,染色體沉默因子Sir2(silentinformationregulator-2)是NAD+依賴的組蛋白去乙?;?,它參與了基因組穩(wěn)定和衰老等多種生理過程[1-2]。Sir2在哺乳動(dòng)物中有七個(gè)家族成員(SIRT1-SIRT7)[3]。近年來,大量研究表明Sirtuin家族成員廣泛參與凋亡,應(yīng)激,分化,衰老,基因表達(dá)等多種生理過程[4]。SIRT7是這個(gè)家族中唯一定位于細(xì)胞核仁的蛋白[5]。也是到目前為止,唯一沒有被鑒定出酶活性
2、的家族成員。SIRT7是Poll聚合酶的活化子,能夠促進(jìn)rDNA轉(zhuǎn)錄。研究表明在乳腺癌和甲狀腺癌中SIRT7mRNA高表達(dá),提示SIRT7可能參與癌癥的發(fā)生過程。因此研究SIRT7基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)于我們了解SIRT7在腫瘤發(fā)生,應(yīng)激等生理過程中的作用具有重要意義。
本文主要研究了SIRT7的啟動(dòng)子和SIRT7蛋白穩(wěn)定性調(diào)控機(jī)制,以及SIRT7在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,并嘗試鑒定了SIRT7的組蛋白與非組蛋白的去乙酰化酶活性
3、。
1、SIRT7mRNA的表達(dá)譜
我們通過Northemblotting和RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)了SIRT7在小鼠主要組織和幾種人漂細(xì)胞系中的表達(dá),結(jié)果顯示SIRT7在小鼠組織中廣泛表達(dá),其中在肝臟組織中表達(dá)最為豐富。在人胚腎細(xì)胞HEK293T,MCF7,Huh7,HepG2,HeLa細(xì)胞中SIRT7均有表達(dá),在肺癌細(xì)胞H1299中幾乎不表達(dá)。
2、5’-RACE確定SIRT7轉(zhuǎn)錄起始
4、位點(diǎn)
提取小鼠肝臟和人急性白血病細(xì)胞HL60RNA,利用SIRT7特異引物以及5’-RACE連接子內(nèi)外引物進(jìn)行巢式PCR,得到長(zhǎng)度為650bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果顯示SIRT7基因在人和鼠中存在單一的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為C堿基,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游沒有典型的TATAbox和GCbox,也沒有明顯的CpG島。
3、克隆并鑒定SIRT7啟動(dòng)子區(qū)
我們首次克隆并鑒定了SIRT7啟動(dòng)子區(qū)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S
5、IRT7的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到上游-2Kb的DNA片段具有啟動(dòng)子活性,并且這種啟動(dòng)子活性具有細(xì)胞特異性。通過啟動(dòng)子刪切實(shí)驗(yàn)表明,-312/-174的DNA片段為SIRT7啟動(dòng)子的關(guān)鍵區(qū)域。通過生物信息學(xué)的方法確定該區(qū)域含有保守的C/EBPa轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
4、Doxorubicin能夠影響SIRT7蛋白穩(wěn)定性,SIRT7蛋白穩(wěn)定性受泛素蛋白酶體途徑調(diào)控.
我們發(fā)現(xiàn)在DNA損傷過程中,MCF7細(xì)胞內(nèi)SIRT7蛋白
6、水平快速下降。而SIRT7mRNA水平卻不下降。表明SIRT7蛋白調(diào)控過程發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平。外源表達(dá)的SIRT7蛋白和內(nèi)源的SIRT7蛋白具有較短的半衰期,其穩(wěn)定性受泛素蛋白酶體的調(diào)控。體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)表明,SIRT7在細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生多聚泛素化。
5、SIRT7在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位.
免疫熒光顯示在HEK293T細(xì)胞和MCF7細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中,外源表達(dá)的Flag-SIRT7并不定位于核仁,而是分布在細(xì)胞核內(nèi)
7、,并且在核膜內(nèi)側(cè)富集。在細(xì)胞分裂期,F(xiàn)lag-SIRT7不與染色體結(jié)合。而全長(zhǎng)的人源EGFP-SIRT7卻主要定位在核仁,在有絲分裂期,EGFP-SIRT7與染色體緊密結(jié)合。結(jié)果表明外源表達(dá)的SIRT7蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位依賴于表達(dá)量和融合標(biāo)簽類型。鑒于商業(yè)化SIRT7抗體特異性差,我們首次生產(chǎn)了識(shí)別小鼠SIRT7蛋白362-379位氨基酸的多克隆抗體,并證明了SIRT7多克隆抗體的特異性。使用SIRT7多克隆抗體,通過免疫熒光法,發(fā)現(xiàn)內(nèi)
8、源SIRT7在HEK293T,Huh7,MCF7細(xì)胞內(nèi)以點(diǎn)狀分布于細(xì)胞核,并且分布區(qū)域DAPI染色較淺。
6、嘗試鑒定SIRT7的去乙?;傅幕钚?br> 我們純化原核表達(dá)的GST融合的SIRT7蛋白,在體外建立組蛋白去乙?;磻?yīng)體系。結(jié)果表明原核表達(dá)的SIRT7沒有組蛋白H4K16的去乙?;幕钚浴S妹庖邿晒夥òl(fā)現(xiàn)在MCF7細(xì)胞內(nèi),外源表達(dá)的SIRT7沒有H3K9Ac,H3K14Ac,H4K5AC,H4K8AC,H
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