4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(ATPR)對(duì)人胃癌SGC-7901移植瘤裸鼠的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)分化治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的成功，使其作為誘導(dǎo)分化劑的代表，一度成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。然而，維甲酸綜合癥等不良反應(yīng)的發(fā)生，限制了其在臨床的進(jìn)一步推廣應(yīng)用,因而,開發(fā)新型、高效、低毒的誘導(dǎo)分化劑成為抗腫瘤治療的主要研究方向之一。本課題組以全反式維甲酸為原料,合成了一系列維甲酸衍生物,抗腫瘤活性的篩選,4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(ATPR)的藥理活性較高,不僅

2、對(duì)白血病細(xì)胞有較好的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用,體外研究還證實(shí)其對(duì)多種消化道實(shí)體瘤也具有誘導(dǎo)分化作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立人胃癌細(xì)胞SGC-7901裸小鼠移植模型,探究ATPR在體內(nèi)對(duì)胃癌細(xì)胞的作用,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。并通過RNA干擾技術(shù)(RNA interference)靶向沉默SGC-7901細(xì)胞的RARβ基因后使用ATPR,觀察ATPR對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖分化能力的影響,旨在初步闡明ATPR抗SGC-7901增殖及誘導(dǎo)分化作用

3、的機(jī)制。
　　目的:
　　本研究旨在觀察新型維甲酸衍生物ATPR對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞裸鼠移植瘤的藥效學(xué)作用及靶向沉默RARβ基因后對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖分化能力的影響。
　　方法:
　　1、SGC-7901細(xì)胞皮下接種:雄性裸小鼠10只于SPF級(jí)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集,每只小鼠注射2×106個(gè)細(xì)胞。待其瘤體長(zhǎng)至1cm3左右時(shí),斷頸處死小鼠,無(wú)菌條件下取出瘤體充分剪碎,皮下

4、注射到傳代裸鼠腋窩處。三代以后,瘤組織作為瘤源皮下移植到103只雄性裸小鼠腋窩處。
　　2、分組及給藥方法:一周后,將91只成瘤小鼠隨機(jī)分為6組:模型組;溶劑組;ATRA組(10mg/kg);ATPR組(5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg)。溶劑組注射聚氧乙烯蓖麻油:PBS=9:1(溶劑),加藥組分組后開始腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物,每隔一天給藥一次,連續(xù)5周。
　　3、療效評(píng)價(jià):接種后,觀察和記錄動(dòng)物死亡時(shí)間,統(tǒng)計(jì)生

5、存天數(shù),計(jì)算生命延長(zhǎng)率。
　　4、其它輔助評(píng)價(jià)療效指標(biāo)的研究:(1)移植瘤重量及體積檢測(cè)。
　　(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:肝、脾、腎、肺及瘤體用10％甲醛固定48h以上,石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,鏡下觀察上述組織形態(tài)。
　　(3)瘤體石蠟切片,經(jīng)過滴加羊抗人COX-2/CEA多克隆抗體,再滴加生物素標(biāo)記的二抗等處理。鏡下觀察COX-2及CEA的表達(dá)變化情況。
　　(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)瘤細(xì)胞周期:稱取適

6、當(dāng)瘤體研磨,70%乙醇-20℃冰箱固定過夜,碘化丙啶(PI)避光染色30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)104以上細(xì)胞。
　　(5)檢測(cè)血清堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)活力:眼球取血,靜置,離心吸取上清,按照堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶試劑盒說明書檢測(cè)兩者活性。
　　5、機(jī)制研究:
　　采用RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)ATPR引起的SGC-7901細(xì)胞中RARβmRNA及蛋白的表達(dá)變化。并采用RNA干

7、擾技術(shù),體外觀察siRNA序列靶向沉默SGC-7901細(xì)胞RARβ后6h加入ATPR(終濃度為10-5mol/L),對(duì)細(xì)胞增殖及相關(guān)酶活性的影響。探究RARβ在介導(dǎo)ATPR作用于SGC-7901細(xì)胞中的作用。
　　結(jié)果:
　　1瘤組織塊懸液注入小鼠腋窩一周后,即可見皮下綠豆般白色小突起,說明模型
　　建立成功。
　　2新型維甲酸衍生物ATPR能夠延長(zhǎng)移植瘤裸小鼠的生存期。
　　3皮下移植瘤小鼠肝、脾、腎、肺

8、等內(nèi)臟器官鏡下與正常小鼠比較未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變。各組小鼠瘤體細(xì)胞在鏡下觀察呈圓形,核大,畸形,排列呈巢狀或索狀,血竇豐富,模型組和溶劑組在鏡下可見部分腫瘤細(xì)胞有2個(gè)或3個(gè)核,中高劑量組可見部分細(xì)胞固縮凋亡。
　　4環(huán)氧合酶-2(COX-2)免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色或棕褐色,用IPP軟件分析光密度值,ATPR高劑量組及ATRA陽(yáng)性藥組瘤體COX-2表達(dá)較模型組和溶劑組明顯降低。
　　5癌胚抗原(CEA)免疫組化

9、CEA蛋白陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,呈棕色,用IPP軟件分析光密度值,ATPR高劑量組及ATRA陽(yáng)性藥組瘤體CEA表達(dá)較模型組和溶劑組顯著降低。
　　6ATPR對(duì)裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)具有抗增殖作用:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用藥組移植瘤G0/G1期細(xì)胞增多。
　　7ATPR對(duì)裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)具有誘導(dǎo)分化作用:分化標(biāo)志酶ALP和LDH檢測(cè)顯示用藥組兩者活性均下降。
　　8MTT法和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:靶向沉默RARβ基因6h后加

10、入ATPR及ATRA作用72h,siRNA-RARβ組、siRNA-RARβ+ATPR組及siRNA-RARβ+ATRA組與未轉(zhuǎn)染直接加ATPR組相比細(xì)胞生長(zhǎng)顯著增多,此三組之間及與空白組相比無(wú)顯著性差異。72h后,ATPR組與空白組相比,細(xì)胞增殖卻明顯減弱。
　　9堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶活力檢測(cè)顯示:RARβ轉(zhuǎn)染沉默后加藥組兩種腫瘤標(biāo)志酶的活力都較直接加藥組明顯增高。
　　結(jié)論:
　　1向裸鼠注射SGC-7901細(xì)胞