4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人肺腺癌A549細(xì)胞株增殖凋亡的影響及其可能機制.pdf

1、研究背景：肺癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率均居所有癌癥之首。近年來，雖然肺癌診斷及治療方式不斷進(jìn)步，但肺癌患者發(fā)病率死亡率不斷上升，因此探索新型高效抗腫瘤藥物勢在必行。
　　目的：探討全反式維甲酸（ATRA）新型衍生物4-氨基-2-三氟-甲基苯基維甲酸酯（ATPR）在體外對肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機制的研究。
　　方法：以A549細(xì)胞為研究對象，經(jīng)ATPR及ATRA處理A549細(xì)胞4

2、8 h，MTT及平板克隆形成實驗觀察其對細(xì)胞的增殖及單細(xì)胞克隆形成能力的影響；Western blot檢測ATPR對增殖相關(guān)蛋白ASPP家族(P53凋亡刺激蛋白家族)、WP53(野生型P53)及其下游P21、MDM2蛋白和凋亡相關(guān)蛋白 BCL-2、Bax、pro-caspase3、NF-κB(P65)蛋白的表達(dá)水平的影響。Hoechst染色用來觀察觀察ATPR對A549細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果：MTT實驗中，不同濃度的ATPR及ATRA（1

3、0、20、25、40、50、75、100μmol/L）處理96孔板中A549細(xì)胞48 h，經(jīng)MTT孵育4 h后測定各組吸光度，并換算成各組細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ATRA處理后各濃度組之間細(xì)胞存活率無明顯差異；而經(jīng)ATPR處理后，從50μmol/L開始到100μmol/L濃度組，隨著ATPR濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸降低。說明ATPR的濃度調(diào)至50μmol/L時，對A549細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用。因此，50μmol/L被選為后續(xù)實驗的主要

4、藥物處理濃度。平板克隆形成實驗中，ATPR及ATRA處理后的單個細(xì)胞接種于6孔板孵育8-10天后，結(jié)晶紫染色處理。再用肉眼及倒置顯微鏡下觀察，與對照組相比，ATPR及ATRA組克隆數(shù)目及單個克隆細(xì)胞數(shù)量減少。且相同濃度下，ATPR組克隆數(shù)目及單個克隆細(xì)胞數(shù)量均較ATRA組減少。經(jīng)ATPR及ATRA處理細(xì)胞48 h后，用 Western blot檢測ASPP家族、WP53及下游P21、MDM2蛋白表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，與對照組相比，A

5、TPR及ATRA處理后iASPP、P21灰度值均有不同程度下降，WP53、MDM2灰度值均有不同程度上升（P<0.05）。而ASPP1及ASPP2經(jīng)藥物處理后灰度值變化與其對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。即ATPR下調(diào)iASPP、P21的表達(dá)，上調(diào)WP53、MDM2的表達(dá)，而對ASPP1、ASPP2表達(dá)無影響。通過Hoechst染色觀察經(jīng)ATPR及ATRA處理48 h后的A549細(xì)胞凋亡情況。倒置熒光顯微鏡視野下，與對照組相比，ATPR及ATR

6、A組細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，且出現(xiàn)凋亡小體。且在相同濃度下，ATPR組凋亡小體數(shù)量比ATRA組增多。通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、Bax、pro-caspase3、NF-κB(P65)表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，與對照組相比，A549細(xì)胞經(jīng)ATPR及ATRA處理后BCL-2、pro-caspase3、NF-κB(P65)灰度值均有不同程度下降，Bax灰度值均有不同程度上升（P<0.05）。即 ATPR下調(diào)