囊泡分子免疫病理學改變對鼻內鏡術后鼻腔粘膜上皮預后轉歸影響的研究.pdf

1、目的：
　　 鼻息肉手術后鼻粘膜預后轉歸是一個非常復雜的過程，涉及囊泡形成、多種炎癥細胞、細胞因子及介質等的參與。尤其是囊泡的形成對鼻粘膜上皮化可以產(chǎn)生重要影響。目前對鼻內鏡術后鼻腔粘膜囊泡的形成機制并不清楚，臨床上是否常規(guī)要清除囊泡也存在爭議。本研究采用病理形態(tài)學、透射電鏡、免疫組化、細胞因子及術后不同方式處理囊泡，探討鼻內鏡術后鼻腔囊泡的分子免疫病理形態(tài)學改變對慢性鼻息肉患者鼻腔術后粘膜預后轉歸的影響，以期為臨床鼻內鏡術后鼻

2、腔粘膜良性轉歸提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.病例及標本
　　 病例選自珠江醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2010-03至2011-08行鼻內鏡手術，術后定期隨訪且粘膜有囊泡、肉芽組織增生的慢性鼻竇炎（雙側，伴鼻息肉）患者48例（96側），其中男27例，女21例，年齡16歲到72歲，平均36.5歲。全部病例根據(jù)慢性鼻竇炎、鼻息肉診斷和治愈標準(2007EPOS標準)納入[1]。所有病例統(tǒng)一手術方式及術前術后用藥情況

3、（口服或靜脈抗生素、糠酸莫米松噴鼻及鼻腔沖洗），均在鼻內鏡下?lián)Q藥。術后換藥以術后20周內作為研究期限。術中取下鼻甲組織（輕輕刮除）、鼻息肉組織、術后鼻腔不同時期的囊泡組織以及完成術腔上皮化后的中鼻道上皮組織。
　　 2.分組及觀察方式
　　 2.1.臨床部分:以96側術腔為研究對象，根據(jù)對囊泡處理方式的不同，將其分為囊泡刮除組和未刮除組，鼻內鏡下觀察比較兩組術后鼻粘膜上皮化情況;同時在換藥的過程中人為地把囊泡組織劃分為輕

4、度組（單側術腔囊泡≤5個，且囊泡直徑均≤5mm）及中重度組(單側術腔囊泡＞5個或囊泡≤5個而囊泡直徑＞5mm)，觀察囊泡的差異是否影響患者術腔的上皮化進程。
　　 2.2.實驗室部分:隨機從臨床部分48側刮除組抽取40側術腔作為研究對象，分別在術中、術后1～3周、術后6～8周及術后11～14周等4個時段采集中鼻道及下鼻甲組織。其中中鼻道的組織為實驗組，同期的下鼻甲組織為對照組。采用HE染色及透射電鏡方法觀察囊泡的病理形態(tài)學變化。

5、運用免疫組織化學法探討各個時期的組織中的轉化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1)和血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表達變化。
　　 3.標本的制備及觀察
　　 3.1.光鏡標本
　　 標本用10％中性福爾馬林固定，自動脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片3張，片厚4μm。分別進行HE染色。光鏡下觀察各黏膜纖毛細胞、杯

6、狀細胞、基底膜、黏膜間質、炎癥細胞和黏液腺體的改變。
　　 3.2.掃描電鏡標本
　　 2.5％戊二醛-2％多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液，固定4h以上;緩沖液漂洗3次，10min/次以上;1％鋨酸-0.1mol/L磷酸緩沖液，固定1.5h;緩沖液漂洗3次，10min/次以上;50％、70％、80％、90％、100％乙醇脫水，10-15min/次;100％丙酮浸泡2次，10-15min/次;丙酮:包埋劑=1:1，浸

7、透1h;丙酮:包埋劑=1:2，浸透3h;純包埋劑浸透過夜;樣品挑出放入包埋板中聚合;60℃約48h至硬化;切1-2μm的半薄片，對照定位后，60-80nm超薄切片，撈于銅網(wǎng)上;飽和醋酸鈾，枸櫞酸鉛染色;SEM觀察纖毛數(shù)量、脫落、紊亂、黏液附著情況。
　　 3.3.炎癥因子VEGF及TGFβ1免疫組織化學染色
　　 VEGF及TGFβ1免疫組織化學采用SP法染色染色，操作步驟按照試劑盒說明書進行，以PBS替代(一)抗設立陰

8、性對照，以已知的陽性組織片作為陽性對照。圖像采集利用OLYMPUSBH-2型攝影生物顯微鏡，在40倍接物鏡下，選取陽性細胞集中的視野，調整圖像效果，使圖像的背底光密度一致。結果判定，陽性細胞可見棕黃色顆粒定位于細胞質或細胞膜。并采用Image-ProPlus6.0軟件進行圖像分析，測量免疫組化切片的陽性面積和積分光密度，通過陽性區(qū)域的平均光密度比較陽性表達的強弱。
　　 4.統(tǒng)計處理
　　 所有計量資料數(shù)據(jù)以(X)±s表

9、示均數(shù)和標準差，選用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析軟件對數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗，術腔上皮化時間比較采用析因設計的方差分析，各組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用Satterthwaite近似t檢驗;VEGF及TGFβ1免疫組織化學表達采用重復測量的方差分析。，同一取材的部位組織不同時間點的免疫組化表達分別采用單向方差分析。Levene方差齊性檢驗，如方差齊，多重比較采用Bonferroni法;如方差不齊，選擇方差不齊的近似F檢驗B

10、rown-Forsythe法，多重比較方差齊性采用Dunnett'sT3法。同一時間點不同部位的免疫組化表達采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.鼻內鏡下囊泡形態(tài)學變化
　　 鼻內鏡下囊泡呈淡黃或灰白色，半透明、質軟、廣基或帶蒂囊性泡狀組織，部分內容物為囊液，部分呈實質性，多位于是篩竇術腔、額竇引流口。隨著術后清理過程的進展，多數(shù)囊泡的透明度下降，部分較大的囊泡清理后創(chuàng)面會

11、再次生成新的囊泡，新生成囊泡體積常較前有所減小。囊泡表面的痂皮等分泌物也隨著時間的推移慢慢減少。鼻內鏡下囊泡與息肉組織不易區(qū)別。
　　 2.病理學結果
　　 2.1.光鏡下囊泡組織均為假復層纖毛柱狀上皮，術后1～3周組的囊泡組織多數(shù)表現(xiàn)為上皮剝蝕，基膜不連續(xù)，細胞間隙寬，間質內大量紅細胞、少量嗜酸性粒細胞浸潤、固有層水腫，上皮層、上皮下層嗜酸性粒細胞浸潤，上皮下可見小血管及腺體增生;6～8周組的囊泡組織多數(shù)上皮層完整連續(xù)

12、，上皮層可見杯狀細胞、嗜酸性粒細胞、纖毛柱狀上皮增多;11～14周的囊泡組織上皮層連續(xù)性良好，上皮下間質細胞增多，腺體成熟，腺體導管內及血管周圍可見嗜酸性粒細胞等浸潤;研究還發(fā)現(xiàn)有2例囊泡組織可見嗜酸性粒細胞聚集的現(xiàn)象，大量的嗜酸性粒細胞等聚集在囊泡組織的上皮下層及細胞間質。
　　 2.2.透射電鏡下見囊泡上皮細胞有相對密集的纖毛組織，排列稍紊亂，其間可見微絨毛，大部分纖毛的橫斷面可見9+2型微管結構，有些中心微管為9+1或者缺

13、如。而對照組鼻息肉組織透射電鏡下可見上皮細胞間隙較大，纖毛稀疏、粗細不均、線粒體腫脹等。
　　 3.分子免疫學結果顯示
　　 3.1.TGFβ1免疫組化結果顯示中鼻道組織:鼻息肉組、術后1～3周組、術后6～8周組、11～14周組的囊泡組織的陽性表達區(qū)域的平均光密度分別是0.63±0.06、0.61±0.06、0.58±0.08、0.39±0.04;同期的下鼻甲組分別是0.34±0.05、0.35±0.06、0.34±0.

14、05、0.35±0.05。細胞因子TGFβ1免疫組織化學表達的變化采用重復測量的方差分析。不同取材部位即中鼻道組織和下鼻甲組織中TGFβ1的表達差異有統(tǒng)計學意義，中鼻道區(qū)域的組織明顯高于下鼻甲(F=1010.957，P=0.000)。;不同的取材時間即術中、術后1～3周、術后6～8周及術后11～14周組織中TGFβ1的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=73.658，P=0.000);組織采集時間和采集部位有顯著交互效應，二者的變化趨勢明顯不同(

15、F=68.958，P=0.000)。中鼻道各組的TGFβ1隨時間一直呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(F=128.247;P=0.000);對應的同期下鼻甲各組變化相對較為平緩，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.236，P=0.871)。TGFβ1主要定位于黏膜下層及間質的炎性細胞胞膜及胞質，炎性細胞聚集的部位表達較強。
　　 3.2.VEGF免疫組化結果顯示中鼻道的組織即術中鼻息肉、術后1～3周組、術后6～8周組、11～14周組的囊泡組織

16、的陽性表達區(qū)域的平均光密度分別是0.28±0.03、0.22±0.03、0.34±0.05、0.23±0.03，同期的下鼻甲組織分別是0.23±0.02、0.24±0.05、0.23±0.03、0.24±0.04;不同取材部位即中鼻道組織和下鼻甲組織中VEGF的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=56.265，P=0.000)。不同的取材時間即術中、術后1～3周、術后6～8周及術后11～14周組織中VEGF的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=43.565

17、，P=0.000)。標本采集時間和采集部位有顯著交互效應，二者的變化趨勢明顯不同(F=49.227，P=0.000)。中鼻道的VEGF至手術后一直呈下降趨勢，至術后術后3周，然后上升，術后6周達到高峰，然后下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=94.608;P=0.000)。對應的同期下鼻甲組織變化相對較為平緩，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.909，P=0.440);VEGF主要定位于血管內皮細胞、部分上皮細胞、部分腺體細胞以及極少數(shù)炎性細胞的胞質。

18、
　　 4.囊泡嚴重程度和處理囊泡方式對鼻術后鼻腔粘膜上皮化的影響結果
　　 4.1.囊泡的輕重程度對患者的上皮化影響具有統(tǒng)計學意義(F=12.628，P=0.001);術后及時刮除術腔的囊泡組織有利于加快術腔的上皮化進程(F=11.120，p=0.000);上述兩因素不存在的交互效應，即囊泡的嚴重程度及刮除與否對術腔黏膜的上皮化不相互影響(F=1.862，p=0.191)。
　　 4.2.中重度囊泡的兩組研究表

19、明，處理組和對照組術腔粘膜上皮化的時間分別為11.3±2.25周、13.6±3.28周。處理組即刮除囊泡組織能使術腔粘膜更快上皮化，鼻腔粘膜上皮化的時間平均縮短約1.5周，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.586，p=0.014)。
　　 4.3.輕度組中兩組比較，處理組和對照組術腔粘膜上皮化的時間分別為9.9±1.71周、11.1±2.09周，囊泡組織的刮除與否對術腔粘膜上皮化進程的影響差異無統(tǒng)計學意義（t=1.814，p=0.075

20、）。
　　 結論：
　　 1.本研究依囊泡數(shù)量及大小可以而且應該劃分為輕度組(單側術腔囊泡≤5個，且囊泡直徑均≤5mm)及中重度組(單側術腔囊泡＞5個或囊泡≤5個而囊泡直徑＞5mm)。
　　 2.術后對中重度囊泡進行及時的清除有利于鼻腔粘膜的恢復愈合，對輕度的囊泡組織采取保留的態(tài)度，可以減少輕患者的換藥次數(shù)。
　　 3.囊泡是鼻內鏡術后有可能經(jīng)歷的階段，其出現(xiàn)可能提示是鼻腔粘膜術后對炎癥存在的反映，存在病