Thymosinβ4及β-aescin早期應(yīng)用對脊髓損傷的保護(hù)作用.pdf

1、實(shí)驗一、Thymosinβ4早期應(yīng)用對脊髓損傷的保護(hù)作用
　　【研究背景】脊髓損傷是一個引起全球廣泛關(guān)注的問題，尤其是近十年來。重度脊髓損傷往往導(dǎo)致患者終身癱瘓。來自臨床研究和動物實(shí)驗的大量證據(jù)均表明，脊髓損傷的預(yù)后，不僅取決于原發(fā)性損傷的嚴(yán)重程度，更是與其所引起的一系列細(xì)胞和分子水平的繼發(fā)性損傷過程的發(fā)展程度密切相關(guān)。這些繼發(fā)性病理過程包括缺血，缺氧，免疫反應(yīng)，興奮性毒性，自由基損傷，神經(jīng)細(xì)胞變性死亡，軸突脫髓鞘和waller變

2、性等。
　　脊髓高度血管化，以滿足它對氧和葡萄糖的高需求，因此缺血往往導(dǎo)致嚴(yán)重的破壞性后果。我們以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不斷擴(kuò)張的脊髓損傷區(qū)的邊緣存在兩個缺血區(qū)，臨近的缺血區(qū)大量神經(jīng)元正在變性或者已經(jīng)消失，稍遠(yuǎn)的缺血區(qū)大多數(shù)神經(jīng)元顯得相對正常并且認(rèn)為可以被拯救。有報道稱，改善創(chuàng)傷后脊髓血流能顯著促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　免疫反應(yīng)被認(rèn)為在脊髓損傷中發(fā)揮類似雙刃劍的作用。浸潤的免疫細(xì)胞可以釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生。

3、但是已有大量研究表明，傷后早期炎癥反應(yīng)以及脊髓損傷后激活的巨噬細(xì)胞可能參與損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病變和運(yùn)動功能損害。
　　神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞均對各種繼發(fā)性有害因素非常敏感而最終經(jīng)歷變性死亡。其中，少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致原發(fā)性損傷后殘存的軸突進(jìn)一步脫髓鞘，使那些軸突的傳導(dǎo)能力受損，這必然顯著影響病人日后神經(jīng)功能的恢復(fù)。
　　Tβ4是一種由43個氨基酸組成的高度保守的小分子多肽，分子量為4.9kD，最初是從小牛胸腺組織中分離得到的。它廣

4、泛存在于幾乎所有的細(xì)胞，尤其在血小板和白細(xì)胞內(nèi)水平相對較高。Tβ4具有促進(jìn)血管發(fā)生，抗炎，促進(jìn)細(xì)胞存活和創(chuàng)傷修復(fù)等特性，而這些均與脊髓損傷修復(fù)密切相關(guān)。但是目前尚沒有Tβ4應(yīng)用于脊髓損傷的相關(guān)報道。本實(shí)驗主要關(guān)注脊髓損傷后，Tβ4促進(jìn)血管發(fā)生，神經(jīng)元保護(hù)和抗炎三方面的作用，并觀察運(yùn)動功能恢復(fù)情況。
　　【目的】利用我們研究所自行設(shè)計的脊髓損傷模型，觀察Tβ4對脊髓損傷的治療作用。
　　【方法】所以大鼠分為3組：假手術(shù)組（n=

5、5），Tβ4（n=15）和生理鹽水組（n=15）。將大鼠麻醉后，使用改良的眼科顯微鑷制作大鼠脊髓夾傷模型。傷后30min，腹腔注射Tβ4溶液，以后每3d給藥1次。至第7d，處死所有大鼠，行組織化學(xué)檢查，RECA1標(biāo)記血管，NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，ED1標(biāo)記活化小膠質(zhì)細(xì)胞和血源性巨噬細(xì)胞，GFAP標(biāo)記膠質(zhì)瘢痕。Westernblotting檢測活化小膠質(zhì)細(xì)胞和血源性巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物ED1和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物MBP的表達(dá)水平。

6、所有大鼠存活7d，在相應(yīng)的時間點(diǎn)對大鼠進(jìn)行BBB評分和足跡實(shí)驗。生理鹽水替代Tβ4作為對照組。
　　【結(jié)果】組織化學(xué)結(jié)果顯示Tβ4組大鼠脊髓空洞面積較鹽水組減少32.1％。血管長度和神經(jīng)元的變化主要存在于距損傷邊界吻、尾側(cè)各1mm范圍內(nèi)。血管總長度，Tβ4組吻、尾側(cè)分別是14.72±0.17mm/mm2和13.35±0.13mm/mm2，鹽水組吻、尾側(cè)分別是12.97±0.45mm/mm2和11.40±0.39mm/mm2；神經(jīng)元

7、數(shù)量，Tβ4組吻尾側(cè)分別是335.1±11.1/mm2和317.7±9.3/mm2，鹽水組吻、尾側(cè)分別是284.8±15.4/mm2和262.1±16.6/mm2。Tβ4和鹽水兩組之間密切相關(guān)。Westernblotting結(jié)果顯示，Tβ4組ED1表達(dá)量較鹽水組下降了35.9％；Tβ4組MBP水平僅下降了20.1％，較鹽水組高44.3％。各種運(yùn)動功能評估方法均顯示，Tβ4組大鼠運(yùn)功功能較鹽水組明顯改善。
　　【結(jié)論】在本實(shí)驗，我們

8、率先發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Tβ4可以顯著減少SCI后損傷面積，加速運(yùn)動功能恢復(fù)，很可能與其刺激血管發(fā)生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和減少炎癥浸潤有關(guān)。Tβ4的臨床安全性已經(jīng)明確，因此它可以作為未來SCI治療的選擇之一。
　　實(shí)驗二、β-aescin早期應(yīng)用對脊髓損傷的保護(hù)作用
　　【研究背景】在SCI，除了原發(fā)性創(chuàng)傷造成的直接損傷外，在其周圍還將發(fā)生不斷擴(kuò)張的繼發(fā)性病理改變，包括缺血，自由基損傷，炎癥反應(yīng)，興奮性毒性，神經(jīng)元變性壞死及凋亡等。脂質(zhì)過氧化

9、（lipidperoxydationLPO）是脊髓損傷后最早出現(xiàn)的生化改變之一，是自由基損傷的延續(xù)，被認(rèn)為是導(dǎo)致原始損傷區(qū)域向外惡化蔓延的重要因素。丙二醛（MDA）是膜結(jié)構(gòu)中多不飽和脂肪酸過氧化的主要終產(chǎn)物，被認(rèn)為是LPO的生物學(xué)標(biāo)記。炎癥反應(yīng)在SCI中的作用類似雙刃劍，炎癥細(xì)胞早期廣泛聚集并分泌大量毒性細(xì)胞因子和自由基而加重SCI，后期合成保護(hù)性細(xì)胞因子及生長因子介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生。
　　Aescin屬三萜類化合物，是從

10、歐洲七葉樹中提取的主要活性成分。Aescin含α和β兩種異構(gòu)體，β-aescin作為主要的活性異構(gòu)體，具有抗炎、抗水腫、清除活性氧、增強(qiáng)靜脈張力和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)研究及臨床治療。
　　本實(shí)驗我們采用成年SD大鼠建立脊髓中度撞擊傷模型。檢測傷后24h脊髓MDA的水平和髓過氧化物酶（MPO）的活性，觀察傷后14d炎癥細(xì)胞的變化。觀察β-aescin對它們的影響，并探討β-aescin的SCI早期治療作用機(jī)制。

11、>　　【目的】采用成年SD大鼠建立脊髓中度撞擊傷模型，觀察β-aescin對大鼠脊髓損傷后繼發(fā)性損害的保護(hù)作用。
　　【方法】所有大鼠分為3組：假手術(shù)組（n=10），Tβ4（n=18）和生理鹽水組（n=18）。造模成功后30min，開始經(jīng)腹腔給予β-aescin（1.0mg/kg）或生理鹽水，3次/d，連續(xù)給藥3d。假手術(shù)組為正常對照。于各時間點(diǎn)采用BBB評分和足跡實(shí)驗對大鼠雙后肢運(yùn)動功能進(jìn)行評估；術(shù)后24h，對損傷部位脊髓組織M

12、DA含量及MPO活性進(jìn)行檢測；術(shù)后14d行免疫組織化學(xué)檢查，利用GFAP觀察損傷星形膠質(zhì)瘢痕及其包圍的壞死空洞，利用ED1觀察活性小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
　　【結(jié)果】β-aescin組運(yùn)動功能明顯改善。傷后24h，β-aescin組大鼠脊髓組織中MDA水平降低67％，MPO活性降低50％。傷后14d，β-aescin組空洞面積減小29.3％，ED1染色陽性面積減少32.3％。
　　【結(jié)論】β-aescin可以顯著減輕SCI后