南蛇藤總萜對人乳腺癌MCF-7-ADM多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用以及相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、化學治療在乳腺癌的綜合治療中占有重要地位，近年來，新的細胞毒性藥物的出現(xiàn)使乳腺癌的治療有了明顯改觀，盡管如此，腫瘤細胞對多種化療產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)仍是造成化療失敗的主要原因，MDR是指惡性腫瘤在接觸一種化療藥物后，除了對這種藥物產(chǎn)生耐藥以外，還對其他結(jié)構(gòu)及作用機制與之不同的化療藥物產(chǎn)生了交叉耐藥的現(xiàn)象。 對于乳腺癌MDR的研究，目前已知有多種機制參與，包括①藥物運輸/攝取如P-糖蛋白

2、(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)等；②代謝解毒如谷胱甘肽(GSH)及其酶系統(tǒng)；③藥物作用效靶如DNA拓撲異構(gòu)酶II(TopoII)；④凋亡途徑改變等。其中認識最早并研究最深入的是P-gp/mdrl介導(dǎo)的MDR，而GSH及其酶系統(tǒng)對細胞藥物解毒及抗氧化過程起重要作用，又可增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的代謝與運輸能力，使細胞產(chǎn)生抗藥性。 現(xiàn)已被證實具有逆轉(zhuǎn)耐藥活性的藥物有鈣通道阻滯劑、免疫調(diào)節(jié)劑、鈣調(diào)蛋

3、白拮抗劑等，因療效欠佳、作用靶點單一、毒副作用大等難以應(yīng)用于臨床。中藥因具有療效確切、多靶點、毒副作用小等優(yōu)點，具有很大的研究價值，所以從中藥中尋找安全有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑是當今研究的熱點。南蛇藤(Celastrus orbiculatus)為衛(wèi)矛科南蛇藤(celastrus)屬植物，分布廣泛，其藤莖、根、葉、果均可入藥。我們課題組研究證實南蛇藤具有較強的抗腫瘤活性，誘導(dǎo)細胞凋亡是其殺傷腫瘤細胞的途徑之一。 目的： 本課題應(yīng)

4、用高效液相色譜(HPLC)法、生物化學法、免疫組化法等探討南蛇藤總萜是否具有逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7/ADM多藥耐藥的作用，并對其可能的逆轉(zhuǎn)機制進行研究，以期為臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 1.MTT法 以MTT法測定南蛇藤總萜對MCF-7(敏感細胞)以及MCF-7/ADM(耐藥細胞)的直接細胞毒作用，以無細胞毒性的南蛇藤總萜作為逆轉(zhuǎn)劑，用MTT法體外觀察其對MCF-7/ADM的逆轉(zhuǎn)作用，測定阿霉素(ADM

5、)對兩種細胞的毒性作用并計算出耐藥倍數(shù)。 2.高效液相色譜(HPLC)法 用HPLC法測定南蛇藤總萜作用于MCF-7以及耐藥細胞MCF-7/ADM后，細胞內(nèi)ADM濃度變化。 3.流式細胞儀(FCM) 用流式細胞儀測定南蛇藤總萜作用于MCF-7以及耐藥細胞MCF-7/ADM后，細胞的凋亡率；通過間接免疫熒光標記法測定南蛇藤總萜作用于MCF-7以及耐藥細胞MCF-7/ADM后，細胞內(nèi)P-gp的表達變化。

6、 4.生物化學法 用生物化學法測定南蛇藤總萜作用于MCF-7/ADM前后，細胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量的變化。 5.細胞免疫組化法 采用細胞免疫組化S-P染色法檢測MCF-7以及耐藥細胞MCF-7/ADM中P-gp的表達率，并檢測南蛇藤總萜作用后，細胞內(nèi)P-gp的表達變化。 結(jié)果： 1.南蛇藤總萜在10μg/ml濃度時對MCF-7以及耐藥細胞MCF-7/ADM沒有毒性，無細胞毒性的南蛇藤總萜(5

7、μg/ml、10μg/ml)可以增強ADM對MCF-7/ADM的細胞毒作用，ADM對MCF-7的半數(shù)抑制率(IC50)是1.09μg/ml，對MCF-7/ADM的IC50是62.62μg/ml，耐藥倍數(shù)是57.45。 2.南蛇藤總萜(5μg/ml、10μg/ml)能夠增加人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADM內(nèi)的ADM的聚積濃度。 3.不同濃度南蛇藤總萜作用后，人乳腺癌敏感細胞MCF-7以及耐藥細胞MCF-7/ADM的凋亡細

8、胞比例升高。利用流式細胞免疫熒光技術(shù)檢測人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADM中P-gp的表達，其表達隨著南蛇藤總萜作用濃度的增加而減少。 4.南蛇藤總萜(10μg/ml)能使MCF-7/ADM細胞內(nèi)GSH含量下降，考慮是其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制之一。 5.南蛇藤總萜(5μg/ml、10μg/ml)作用于人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADM后，細胞內(nèi)P-gp的表達有所下降。 結(jié)論： 南蛇藤總萜具有一定體外抗乳腺癌作用