外源性PTH1-34可緩解FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變所致軟骨發(fā)育障礙及骨折愈合延遲.pdf

1、FGFR3的十多種功能增強(qiáng)型(Gain-of-function)點(diǎn)突變可引起多種人類軟骨發(fā)育障礙性侏儒,包括軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia,ACH)、季肋發(fā)育不全(Hypochondroplasia,HCH)、致死性骨發(fā)育不全(Thanatophoric Dysplasia,TD)等。95％以上的軟骨發(fā)育不全由FGFR3的功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變引起。軟骨發(fā)育不全是一種常染色體顯性遺傳病,是人類侏儒最常見(jiàn)的類型。軟骨發(fā)育不全主要影響

2、經(jīng)軟骨內(nèi)成骨(Endochondral Ossification)過(guò)程形成的四肢骨等長(zhǎng)骨(Long Bone)。這些患者除可通過(guò)外科手術(shù)進(jìn)行部分延長(zhǎng)肢體外,目前尚無(wú)有效的治療方法。
　　 Chen等利用基因敲入技術(shù)建立了模擬人ACH的FGFR3G369C點(diǎn)突變小鼠模型,個(gè)體明顯短小,頭顱短圓,長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,軟骨細(xì)胞增殖、分化能力減弱;Deng等發(fā)現(xiàn),FGFR3基因敲除小鼠(FGFR3-/-)有長(zhǎng)骨過(guò)度生長(zhǎng)、生長(zhǎng)板增

3、殖軟骨細(xì)胞帶和肥大軟骨細(xì)胞帶變寬、軟骨細(xì)胞增殖活性增加。這些結(jié)果提示FGFR3是軟骨發(fā)育的負(fù)性調(diào)節(jié)分子,影響軟骨細(xì)胞的增殖活性和分化。
　　 Chen等發(fā)現(xiàn),FGFR3信號(hào)通過(guò)STATs和Ihh抑制軟骨細(xì)胞增殖,FGFR3信號(hào)可能與PTHrP/IHH信號(hào)相互獨(dú)立抑制軟骨細(xì)胞分化。Yamanaka等發(fā)現(xiàn)表達(dá)FGFR3ACH(FGFR3 G380R)和TDII(FGFR3 K650E)突變的ATDC5細(xì)胞凋亡增加,給予PTHrP處理

4、后可緩解。Ueda等發(fā)現(xiàn),PTH1-34抑制軟骨細(xì)胞分化和凋亡,增加骨長(zhǎng)度,可以一定程度上緩解FGFR3突變對(duì)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)遲緩帶來(lái)的影響。PTH1-34可能一定程度上緩解FGFR3功能增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞與組織帶來(lái)的生長(zhǎng)受損。那么PTH1-34是否能在動(dòng)物水平上緩解FGFR3功能增強(qiáng)所引起的軟骨發(fā)育不全,有待于進(jìn)一步研究。
　　 FGFR3除影響骨骼發(fā)育外,還參與骨折修復(fù)的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室Su等發(fā)現(xiàn)FGFR3在骨折愈合過(guò)程中通過(guò)抑制軟骨形成、分

5、化以及礦化軟骨基質(zhì)降解導(dǎo)致骨折愈合延遲。如何緩解FGFR3激活引起的骨骼發(fā)育異常及骨折修復(fù)延遲有重要的臨床意義。
　　 重組人PTH1-34氨基酸片段的多肽類激素藥物特立帕肽(teriparatide)是得到美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的用于臨床治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松的藥物,其機(jī)制與其促進(jìn)成骨有關(guān)。此外,一些工作觀察了其對(duì)骨折愈合的影響。Alkhiary和Nakazawa研究發(fā)現(xiàn)PTH1-34可能通過(guò)增加軟骨形成來(lái)刺激軟

6、骨內(nèi)成骨。PTH1-34是否可緩解ACH小鼠由于軟骨形成分化障礙所引起的骨折愈合延遲還有待于研究。
　　 據(jù)此,本課題利用野生型和FGFR3G369C/+(ACH)小鼠,間斷給予外源性PTH處理,通過(guò)分析各組小鼠的骨骼表型,觀察外源性PTH對(duì)FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變所致的軟骨發(fā)育障礙的影響。此外,我們還初步觀察了外源性PTH對(duì)FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變所致的骨折愈合延遲的影響。
　　 主要實(shí)驗(yàn)方法:
　　 第一

7、部分:外源性PTH1-34對(duì)FGFR3G369C/+小鼠骨骼生長(zhǎng)抑制的影響
　　 采用X線攝影、全骨架染色和頭顱局部攝影,觀察小鼠大體形態(tài)及顱底軟骨聯(lián)結(jié)的變化情況,測(cè)定小鼠生長(zhǎng)過(guò)程中體重、體長(zhǎng)等的變化。
　　 1.動(dòng)物模型:采用新出生生當(dāng)日的WT及ACH小鼠,分別隨機(jī)分為給藥組與對(duì)照組,給藥組給予80μg/(kg-d)PTH1-34皮下注射,對(duì)照組給予等量注射用水直至觀察期結(jié)束;
　　 2.制備了不同年齡不同組別

8、小鼠的組織切片,通過(guò)HE、藏紅固綠染色觀察生長(zhǎng)板形態(tài)和第二骨化中心的發(fā)育情況;通過(guò)BrdU摻入后免疫組化檢測(cè),觀察生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖情況;
　　 3.測(cè)量小鼠生長(zhǎng)板肥大帶的寬度,采用定量PCR檢測(cè)軟骨組織COL2A1、COL10A1和PTHrP的表達(dá)情況;
　　 4.建立胎鼠脛骨及跖骨體外培養(yǎng)模型;采用PTH1-34間斷處理培養(yǎng)的野生、突變(ACH)小鼠趾骨,觀測(cè)其對(duì)跖骨生長(zhǎng)的影響;
　　 5.PTH處理培養(yǎng)的原

9、代軟骨細(xì)胞,觀察其增殖分化的改變以及對(duì)FGFR3表達(dá)水平的影響。
　　 第二部分:外源性PTH1-34對(duì)FGFR3G369C/+小鼠骨折愈合延遲的影響
　　 1.制作小鼠脛骨近端穩(wěn)定骨折模型,各基因型分別隨機(jī)分為給藥組與對(duì)照組,術(shù)后當(dāng)日起給藥組給予80μg/(kg·d)PTH1-34皮下注射,對(duì)照組給予等量注射用水直至觀察期結(jié)束;
　　 2.利用X線攝片和藏紅固綠染色觀察骨折愈合情況;
　　 3.檢測(cè)小鼠

10、血清鈣、磷含量;
　　 4.檢測(cè)骨痂中軟骨細(xì)胞分化相關(guān)基因COL2A1、COL10A1、PTHrP和成骨相關(guān)的基因cbfa-1和OCmRNA變化觀察軟骨分化情況。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、外源性PTH1-34可部分緩解FGFR3功能增強(qiáng)所致的骨骼生長(zhǎng)抑制
　　 (一)對(duì)FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變小鼠一般生長(zhǎng)情況的影響
　　 在觀測(cè)期1 w-8 w內(nèi),給予PTH1-34的ACH小鼠體重、鼻-

11、肛門長(zhǎng)度增長(zhǎng)較對(duì)照ACH小鼠明顯;顱底軟骨連接提前閉合有所改善;枕骨大孔狹窄無(wú)明顯改善。
　　 (二)對(duì)FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變小鼠軟骨內(nèi)成骨的影響
　　 1.BrdU摻入檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),給予PTH1-34的ACH小鼠軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)較對(duì)照ACH小鼠高;P16給予PTH1-34的ACH小鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖帶較ACH寬;原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)給予PTH1-34處理的ACH小鼠軟骨細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。

12、　　 2.觀察出生14 d小鼠的生長(zhǎng)板,發(fā)現(xiàn)給予PTH1-34的ACH小鼠的第二骨化中心較ACH對(duì)照小鼠的提前出現(xiàn),P7、P10,給予PTH1-34的ACH小鼠生長(zhǎng)板肥大帶明顯較ACH對(duì)照小鼠增寬;熒光定量PCR提示:給予PTH1-34的ACH小鼠生長(zhǎng)板軟骨及原代細(xì)胞的COL10A1 mRNA表達(dá)水平較ACH-小鼠高。
　　 (四)胚胎跖骨培養(yǎng)
　　 建立了跖骨體外培養(yǎng)7 d的模型,ACH胎鼠(E16.5)跖骨在給予P

13、TH1-34間斷處理后提示:處理組跖骨生長(zhǎng)率明顯較未處理組高,主要增長(zhǎng)的是軟骨區(qū)域,提示:間斷PTH1-34處理可促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)。
　　 (五)可能機(jī)制的研究
　　 外源性PTH1-34處理原代軟骨細(xì)胞后FGFR3的mRNA及蛋白質(zhì)水平均降低。
　　 二、外源性PTH1-34可部分緩解FGFR3功能增強(qiáng)所致的骨折愈合延遲
　　 1.X光攝片提示給藥組骨痂密度和骨連接程度較對(duì)照組高:骨折14天,ACH對(duì)照組小

14、鼠骨痂較處理組小,而且鈣化密度較低;骨折28天,ACH對(duì)照小鼠骨折線隱約可見(jiàn),而ACH給藥組小鼠骨折基本愈合;
　　 2.藏紅固綠染色提示:骨折7天,給予PTH1-34的ACH小鼠骨痂中出現(xiàn)大量軟骨,并且部分已進(jìn)入肥大期;骨折14天,PTH1-34給藥組ACH小鼠的軟骨痂體積小于對(duì)照組;骨折21天,ACH對(duì)照組小鼠的骨痂中仍可見(jiàn)殘留軟骨組織,而ACH給藥組小鼠中未見(jiàn);
　　 3.給予外源性PTH1-34對(duì)血清鈣磷無(wú)明顯影

15、響,定量PCR提示,骨折早期,ACH給藥組骨痂中的COL10A1 mRNA表達(dá)增高,PCNAmRNA表達(dá)增高;骨折中期,ACH給藥組骨痂中的OC mRNA表達(dá)增高。
　　 主要結(jié)論:
　　 一、外源性PTH1-34可部分緩解FGFR3功能增強(qiáng)所致軟骨發(fā)育不全
　　 1.間斷給予PTH1-34的ACH小鼠大體表型較ACH對(duì)照小鼠有所緩解;
　　 2.間斷給予PTH1-34可使ACH軟骨細(xì)胞增殖活性較ACH對(duì)

16、照小鼠增高;
　　 3.間斷給予PTH1-34可使ACH生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞分化較ACH對(duì)照小鼠有所改善;
　　 4.間斷給予PTH1-34處理可以促進(jìn)小鼠跖骨生長(zhǎng);
　　 5.間斷給予PTH1-34處理促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖分化可能與FGFR3的表達(dá)降低有關(guān)。
　　 二、外源性PTH1-34可部分緩解FGFR3功能增強(qiáng)所致骨折愈合延遲
　　 外源性PTH1-34可通過(guò)促進(jìn)小鼠骨折早期軟骨痂的形成及中后期軟