Fgfr2 S252W功能增強(qiáng)型突變對小鼠下頜骨及牙齒影響研究.pdf

1、研究背景：
　　依據(jù)序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育的不同,成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactors,FGFs)及其受體成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblastgrowthfactorreceptors,FGFRs)家庭分別有22個FGF成員和5個FGFR成員。成纖維細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合所構(gòu)成的FGFs/FGFRs信號傳遞是胚胎發(fā)育、血管新生、骨骼形成、腫瘤形成及傷口愈合、纖維化的重要原因之一

2、。FGFRs是一個多基因家族,屬免疫球蛋白基因超家族成員,均為酪氨酸激酶受體,在細(xì)胞的增殖、分化、血管生成、骨骼發(fā)育及生長和發(fā)育相關(guān)的進(jìn)程中起著十分重要的作用。其中FGFR2的突變可引起一系列疾病,其外顯子Ⅲa突變可引起Apert綜合癥(Apert Syndrome,AS),一種常見的人類多顱縫早閉所致的綜合征,主要由兩種Fgfr2功能增強(qiáng)型突變,即Fgfr2Ser252Trp(S252W)或者Pro253Arg(P253R)突變引起。

3、Fgfr2S252W突變患者主要表現(xiàn)出嚴(yán)重的顱面部骨骼畸形,包括突眼和中面部嚴(yán)重發(fā)育不良,口腔臨床表現(xiàn)為腭蓋高拱,部分患者伴有腭裂,牙列擁擠和開牙合、錯牙合畸形,遲萌,異位萌出,鏟型切牙,額外牙,牙槽嵴膨隆,滯生牙,局部萌出等,給患者帶來嚴(yán)重的生理缺陷及心理障礙,因此,尋求最佳模擬Apert綜合征的模式動物進(jìn)行研究刻不容緩。
　　目前,多數(shù)研究集中于S252W突變引起的頭顱和長骨及其信號通路的異常,然而,僅有少量報道研究下頜骨的改

4、變。杜等利用EDMA定量比較了突變小鼠和對照小鼠下頜骨的形態(tài)和發(fā)育變化,發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長,突變體下頜骨的縮短變得越來越嚴(yán)重。然而,下頜骨的發(fā)育是一個連續(xù)的、動態(tài)的過程,先前研究只是集中于突變體下頜骨解剖形態(tài)的改變,少有資料研究FGFR2S252W突變小鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)改變與年齡相關(guān)的動態(tài)變化。本課題利用基因敲入技術(shù)建立Fgfr2功能增強(qiáng)型突變小鼠進(jìn)行研究。觀察分析Fgfr2S252W突變小鼠骨骼表型的變化,探討該小鼠作為Apert綜合征

5、小鼠模型的可行性。同時利用多種技術(shù)手段,從整體動物水平和組織蛋白等水平多層次、多角度地分析Fgfr2S252W功能改變對小鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)及牙齒結(jié)構(gòu)的影響,初步探討Apert綜合征發(fā)病的遺傳機(jī)制,為尋找相應(yīng)臨床治療措施提供一定的實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　第一部分，F(xiàn)gfr2S252W功能增強(qiáng)型突變對小鼠下頜骨影響研究
　　1.Fgfr2S252W模式動物的繁殖、鑒定與分組:將雌性帶neo基因+突變Fgfr2的基因

6、工程小鼠和雄性EIIa-Cre小鼠交配,在子代中獲得約1/4數(shù)量的Fgfr2S252W功能增強(qiáng)型突變小鼠。在納入實驗前,提取胎鼠或新生小鼠腳趾DNA作PCR基因型鑒定,提取肝臟總蛋白作Fgfr2蛋白表達(dá)測定,按照基因型分為野生型對照組(+/+)和突變型(S252W/+)兩組進(jìn)行相關(guān)實驗研究。
　　2.突變/對照小鼠體質(zhì)量、鼻-肛門長度、下頜骨鈣磷含量測定及阿爾辛藍(lán)-茜素紅骨架染色判斷突變小鼠骨量變化。測定血清鈣磷含量,了解體內(nèi)鈣磷

7、代謝是否與骨骼礦化有關(guān)。
　　3.為研究FGFR2S252W小鼠下頜骨骨量變化時骨骼微結(jié)構(gòu)有無改變,實驗利用H&E染色及MicroCT從二維及三維角度對P28和P56齡小鼠骨松質(zhì)和骨皮質(zhì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。
　　4.通過鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)檢測下頜骨礦化沉積率,甲苯胺藍(lán)染色檢測成骨細(xì)胞數(shù)量,TRAP染色檢測下頜骨破骨細(xì)胞數(shù)量。
　　5.通過免疫熒光技術(shù)檢測Erk1/2通路在Fgfr2S252W突變小鼠下頜骨生長障礙中的表達(dá)變

8、化。
　　第二部分，F(xiàn)gfr2S252W功能增強(qiáng)型增強(qiáng)對小鼠下頜牙齒影響研究
　　1.Fgfr2S252W模式動物的繁殖、鑒定與分組:同第一部分。
　　2.突變/對照小鼠下頜切牙的口外觀察及離體對比觀察,下頜切牙。下頜切牙和第一磨牙形態(tài)學(xué)Micro-CT測量。第一磨牙H&E染色觀察成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞的變化。
　　3.鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)檢測突變/對照小鼠牙齒礦化沉積率。
　　4.E13.5(蕾狀期)、E15

9、.5(帽狀期)、E18.5(鐘狀期)天胎鼠突變組和野生對照組乳鼠下頜切牙、第一磨牙形態(tài)觀察。
　　5.突變/對照小鼠下頜第一磨牙牙囊組織及牙乳頭組織中p-ERK1/2表達(dá)差異比較。
　　主要結(jié)果:
　　一、Fgfr2S252W突變致小鼠下頜骨骨量減少,微結(jié)構(gòu)改變
　　1.Fgfr2S252W功能增強(qiáng)型突變小鼠具有類似人類Apert綜合征的典型骨骼表型。包括冠狀縫、PF縫早閉,圓顱和短顱畸形、中臉發(fā)育不良,下頜切牙

10、伸長、反牙合等。
　　2.從P7到第P56,每周測量突變小鼠和對照小鼠的體質(zhì)量和鼻-肛門長度,均存在顯著差異,且隨著時間的延長,差異越來越明顯,全骨架染色顯示突變小鼠整體骨架縮小。P28和P56,鈣磷含量在突變小鼠和對照小鼠血清中無差異,突變體體內(nèi)鈣磷代謝水平正常,提示Fgfr2S252W突變沒有影響體內(nèi)鈣磷代謝。但鈣磷含量在下頜骨中差異顯著,提示FGFR2功能增強(qiáng)型點突變可能是直接影響了骨礦化,且與年齡無關(guān)。
　　3.在P

11、28和P56,突變小鼠礦化沉積率MAR均降低,甲苯胺藍(lán)染色陽性的成骨細(xì)胞數(shù)量占骨表面的百分比(ob.s/BS)(％)均降低,TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞數(shù)量在單位骨面積上含量均增多。提示FGFR2S252W突變可能導(dǎo)致了成骨細(xì)胞數(shù)量減少或功能降低,破骨細(xì)胞數(shù)量增多,且與年齡無關(guān)。
　　4.下頜骨MicroCT定量的三維結(jié)構(gòu)參數(shù)是對H&E二維染色結(jié)果的進(jìn)一步驗證,結(jié)果顯示:在P28和P56,突變小鼠與對照小鼠比較,其骨松質(zhì)的BV/TV

12、、Tb.Th、Conn.D及DA均下降,Tb.N,Tb.Sp和SMI分別顯著增加,骨皮質(zhì)中BV/TV和C.Th降低,SMI升高,突變小鼠下頜骨結(jié)構(gòu)的改變與年齡無關(guān)。
　　5.采用免疫熒光技術(shù)研究磷酸化的Erk1/2在突變小鼠下頜骨骨組織中改變情況。結(jié)果顯示,提高放大倍數(shù)后光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),突變小鼠下頜骨骨細(xì)胞中熒光信號增強(qiáng),Erk1/2在突變小鼠骨組織中被激活。
　　二、Fgfr2S252W突變致小鼠下頜切牙及第一磨牙異常

13、
　　1.突變組小鼠下頜切牙、第一磨牙冠長及冠根比較對照組增加。
　　2.突變小鼠切牙礦化生長速率MRA明顯高于對照小鼠。
　　3.下頜切牙H&E染色顯示Fgfr2S252W突變致成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變及數(shù)量增加,頸環(huán)縮小,上皮隔皺縮。第一磨牙H&E染色顯示成釉細(xì)胞數(shù)量增加,成牙本質(zhì)細(xì)胞無明顯改變。
　　4.對照小鼠下頜切牙成釉器E13.5(蕾狀期)、E15.5(帽狀期)、E18.5(鐘狀期)的發(fā)育均稍滯

14、后于同時期突變小鼠牙胚的發(fā)育。同樣現(xiàn)象出現(xiàn)在第一磨牙成釉器的各個發(fā)育時期。
　　5.WB檢測Fgfr2S252W功能增強(qiáng)型突變小鼠的牙囊組織、牙乳頭組織中p-Erk1/2表達(dá)均增強(qiáng)。
　　主要結(jié)論:
　　1.通過基因敲入技術(shù)建立的Fgfr2S252W突變小鼠具有Apert綜合征患者典型的顱面畸形,有望成為研究Apert綜合征下頜骨及牙齒異常機(jī)制的良好模式動物模型。
　　2.Fgfr2S252W功能增強(qiáng)型點突變導(dǎo)致

15、小鼠下頜骨骨量下降及微結(jié)構(gòu)的改變,且與年齡無關(guān)。
　　3.Fgfr2S252W功能增強(qiáng)型點突變小鼠下頜骨骨量的下降可能由其成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞功能及數(shù)量改變共同引起。
　　4.FGFR2功能增強(qiáng)后可能通過激活牙囊組織、牙乳頭組織中Erk1/2信號通路導(dǎo)致突變小鼠下頜牙齒生長發(fā)育異常。
　　綜上所述:
　　本課題的研究結(jié)果表明建立的Fgfr2S252W突變小鼠是研究Apert綜合征的良好模式動物模型之一。本課題提示F