VARS2和FGFR2基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌易感性及FGFR2基因剪接相關(guān)研究.pdf

1、乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在不斷上升。在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的30-32％，占女性惡性腫瘤之首。在我國(guó)的部分發(fā)達(dá)省市，乳腺癌的發(fā)病率也已躍居第一位。乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性身心健康的疾病。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多階段多基因參與的事件，在正常乳腺上皮轉(zhuǎn)化為惡性乳腺癌的過(guò)程中，多個(gè)基因發(fā)生了有序的改變。乳腺癌是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，在相同的致癌因素作用下，只有小部分人發(fā)生乳腺癌，提示遺傳背景的

2、差異導(dǎo)致個(gè)體對(duì)乳腺癌易感性的不同。目前研究較多的與乳腺癌易感性相關(guān)的基因有BRCA1和BRCA2基因，研究顯示BRCA突變基因攜帶者在任何年齡發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性都比非攜帶者大。但BRCA基因突變所引起乳腺癌的比例大約只占5％～10％，這說(shuō)明還存在其他的與乳腺癌相關(guān)的易感基因。近年來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)為研究那些低外顯率高變異頻率的易感位點(diǎn)提供了良好的技術(shù)支持。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了大量的和乳腺癌相關(guān)的易感基因和單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，例如

3、FGFR2、LSP1、MAP3K1、TGFB1、TOX3等。VARS2基因即位于人類HLA基因區(qū)，它的主要功能為編碼ValRS合成。國(guó)外有研究推測(cè)此基因與肺癌及一些自身免疫性疾病有一定關(guān)系，也有報(bào)道認(rèn)為此基因的變異和早期乳腺癌的預(yù)后有一定相關(guān)性。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(FGFR2)是酪氨酸激酶受體家族的成員之一，它的主要作用是介導(dǎo)FGFs信號(hào)傳導(dǎo)，在細(xì)胞的增殖、分化、血管生成、骨骼發(fā)育以及人體的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。FGF

4、R2已經(jīng)被證實(shí)和許多疾病相關(guān)，尤其FGFR2與腫瘤的關(guān)系成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。GWAS已經(jīng)證實(shí)FGFR2基因是乳腺癌易感基因之一，尤其是它的第2個(gè)內(nèi)含子中存在8個(gè)SNP位點(diǎn)rs35054928，rs2981578，rs2912778, rs2912781, rs35393331, rs10736303, rs7895676, rs33971856，已經(jīng)證實(shí)與增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)。此外，F(xiàn)GFR2基因的選擇性剪接也成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)

5、。其中FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC是其中最重要的兩種剪接變異體，F(xiàn)GFR2基因的第三個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域的互相排斥的選擇性剪接產(chǎn)生了FGFRⅢB受體或者FGFR2ⅢC受體。國(guó)外已有研究報(bào)道在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)FGFR2ⅢB向FGFR2ⅢC亞型的轉(zhuǎn)化，并且認(rèn)為這種轉(zhuǎn)化與癌腫的浸潤(rùn)能力增強(qiáng)有關(guān);也有學(xué)者在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了FGFR2ⅢC比FGFR2ⅢB的表達(dá)量高。因此我們推測(cè)FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC的表達(dá)與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)。本研究主要分為

6、三個(gè)部分：
　　 第一部分：VARS2和FGFR2基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)女性乳腺癌易感性的研究。
　　 目的：探討VARS2（valyl-tRNA synthetase2）基因中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphisms，SNP) rs2249464與廣東省漢族女性散發(fā)性乳腺癌的相關(guān)性。
　　 方法：采用MassARRAY(@)-IPLEX SNP分型技術(shù)，以南方醫(yī)科大學(xué)

7、南方醫(yī)院的216例廣東漢族乳腺癌患者及216例同期健康體檢者為研究對(duì)象，對(duì)rs2249464多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，利用x2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析病例組和對(duì)照組的基因型頻率有無(wú)差異，利用非條件Logistic回歸計(jì)算比數(shù)比(odds ratio，OR)和95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)來(lái)評(píng)價(jià)此位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性。然后進(jìn)一步將病例組按雌激素受體(estrogen receptor, ER)和孕激素受體(prog

8、esteronereceptor, PR)免疫組化結(jié)果行分層分析。
　　 結(jié)果：rs2249464位點(diǎn)C/C，C/T，T/T3種基因型分布在對(duì)照組和病例組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)免疫組化情況進(jìn)一步分層分析結(jié)果表明rs2249464的基因型分布在ER陽(yáng)性/陰性組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但在PR陽(yáng)性/陰性組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 結(jié)論：VARS2基因rs2249464位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與

9、廣東漢族散發(fā)性乳腺癌的易感性具有相關(guān)性，且攜帶T/T基因型的患者更容易罹患PR陰性乳腺癌。
　　 第二部分：FGFR2基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)女性乳腺癌易感性的研究。
　　 目的：探討FGFR2基因中5個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Rs1078806、Rs2420946、Rs2981579、Rs7895676和Rs1219648）與中國(guó)女性散發(fā)性乳腺癌的相關(guān)性。
　　 方法：采用MassARRAY(@)-IPLEX SN

10、P分型技術(shù)，分別收集來(lái)自廣東、江西、山東、重慶四個(gè)地區(qū)845例乳腺癌患者及同期健康體檢的882例正常人的血清為研究對(duì)象，對(duì)Rs1078806、Rs2420946、Rs2981579、Rs7895676和Rs1219648多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，利用x2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析病例組和對(duì)照組的基因型頻率有無(wú)差異，利用非條件Logistic回歸計(jì)算比數(shù)比(odds ratio，OR)和95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)來(lái)評(píng)價(jià)

11、此位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性。然后進(jìn)一步將病例組按雌激素受體(estrogen receptor, ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)免疫組化結(jié)果行分層分析。
　　 結(jié)果：⑴Rs1078806位點(diǎn)C/C，C/T，T/T3種基因型分布在對(duì)照組和病例組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)免疫組化情況進(jìn)一步分層分析結(jié)果表明Rs1078806的基因型分布在ER陽(yáng)性/陰性組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但

12、在PR陽(yáng)性/陰性組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑵Rs2420946位點(diǎn)C/C，C/T，T/T3種基因型分布在對(duì)照組和病例組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)免疫組化情況進(jìn)一步分層分析結(jié)果表明Rs2420946的基因型分布在ER陽(yáng)性/陰性組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;并且在PR陽(yáng)性/陰性組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。⑶Rs2981579位點(diǎn)C/C，C/T，T/T3種基因型分布在對(duì)照組和病例組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)免

13、疫組化情況進(jìn)一步分層分析結(jié)果表明Rs2981579的基因型分布在ER陽(yáng)性/陰性組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;并且在PR陽(yáng)性/陰性組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑷Rs7895676和Rs1219648兩位點(diǎn)經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)Hardy-Weinberg不平衡(P＜0.05）。
　　 結(jié)論：①FGFR2基因Rs2420946和Rs2981579位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與女性乳腺癌的具有相關(guān)性，其中在Rs2420946和R

14、s2981579兩個(gè)位點(diǎn)中攜帶T/T基因型的人群患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。②Rs1078806位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性和孕激素受體的狀態(tài)相關(guān)。③Rs2420946和Rs2981579 T/T基因型攜帶的乳腺癌患者的激素受體狀態(tài)更容易為陽(yáng)性。
　　 第三部分：FGFR2基因剪接體亞型與乳腺癌的相關(guān)研究。
　　 目的：探討FGFR2基因剪接變異體與乳腺癌的關(guān)系，及FGFR2基因剪接變異體與臨床病理資料之間的相關(guān)性。
　　 方法

15、：收集來(lái)自南方醫(yī)院乳腺科的35例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織。利用限制性內(nèi)切酶技術(shù)，用限制性內(nèi)切酶AVAI和ECORV剪切FGFR2基因片段（外顯子6-9）區(qū)分FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC的表達(dá)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在紫外透射儀下觀察FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC的表達(dá);之后利用熒光定量PCR的方法測(cè)定FGFR2ⅢB亞型和FGFR2ⅢC亞型的mRNA的絕對(duì)定量，用非參數(shù)檢驗(yàn)的方法分析FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC mRNA的表達(dá)在乳腺癌

16、組織和正常組織中的差異，并根據(jù)臨床病理資料進(jìn)一步分析FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC mRNA表達(dá)在不同分組中的差異。
　　 結(jié)果：⑴FGFR2ⅢB基因經(jīng)AVAI酶切后產(chǎn)生2個(gè)片段（70bp和230bp），F(xiàn)GFR2ⅢC基因經(jīng)ECORV酶切后產(chǎn)生2個(gè)片段(180bp和120bp)，在15例乳腺癌標(biāo)本中15例有FGFR2ⅢB表達(dá)，7例乳腺癌標(biāo)本中有FGFR2ⅢC表達(dá)。⑵FGFR2ⅢB、FGFR2ⅢC分別在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)無(wú)顯

17、著差異(P＞0.05);在癌組織和癌旁組織中FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC的表達(dá)有顯著差異，癌組織和癌旁組織中的FGFRⅢB均的表達(dá)量顯著高于FGFR2ⅢC(P＜0.05)；⑶癌癥組中FGFR2ⅢB、FGFR2ⅢC各自的表達(dá)量在不同年齡組中有顯著差異，在年齡＜50組中FGFR2ⅢB及FGFR2ⅢC的表達(dá)量均明顯大于年齡＞50組的乳腺癌患者(P＜0.05);而癌癥組中FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC表達(dá)差異在不同年齡組中無(wú)明顯差異(P＞0.

18、05)；⑷癌癥組中FGFR2ⅢB、FGFR2ⅢC各自的表達(dá)量在不同臨床分期分組中有顯著差異，在臨床分期為Ⅲ和Ⅳ組中FGFR2ⅢB及FGFR2ⅢC的表達(dá)量均明顯大于臨床分期為0、Ⅰ和Ⅲ期組的乳腺癌患者(P＜0.05);而癌癥組中FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC表達(dá)差異在不同臨床分期分組中無(wú)明顯差異(P＞0.05)。⑸癌癥組中FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC各自表達(dá)量在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);癌癥組中FGFR2ⅢB和F

19、GFR2ⅢC之間表達(dá)量在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中無(wú)明顯差異(P＞0.05)。⑹癌癥組中的FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC各自的表達(dá)量，以及FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC的表達(dá)差異在不同ER、PR、HER2、分子分型分組中無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：①FGFR2基因剪接體的亞型在乳腺癌中的表達(dá)有顯著差異，其中更多表達(dá)FGFR2ⅢB。②癌組織中FGFR2ⅢB和FGFR2ⅢC的表達(dá)在年齡較小的乳腺癌患者中表達(dá)更高。③癌組織中F