人黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE-B18與核因子kB調(diào)控蛋白TNIP1相互作用的研究.pdf

1、人黑色素瘤相關(guān)抗原MAGEB18與核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl相互作用的研究中文摘要目的：旨在探討人黑色素瘤相關(guān)抗原MAGEB18與核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl間的相互作用，同時(shí)確定其相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，從而了解其相互結(jié)合的具體分子機(jī)制。在明確其分子作用機(jī)制后，采用多種手段證實(shí)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。為該抗原的功能研究奠定基礎(chǔ)。方法：將人核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl及人黑色素瘤相關(guān)抗原MAGEB18共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用免疫共沉淀鑒定hM

2、AGEB18與TNIPl在293T細(xì)胞中是否存在相互作用。確定其能夠相互結(jié)合后，使用PCR方法構(gòu)建這兩種蛋白缺失不同結(jié)構(gòu)域的突變體攜帶HA及Myc標(biāo)簽的真核表達(dá)載體并使其在293T細(xì)胞中表達(dá)后；再次使用免疫共沉淀確定其具體的結(jié)合位點(diǎn)。了解其相互結(jié)合的集體分子機(jī)制后，使用WesternBlotting等手段觀察其下游信號(hào)分子的活化情況。并使用流式細(xì)胞術(shù)觀測(cè)293T細(xì)胞活化后細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果：免疫共沉淀結(jié)果表明TNIPl與MAGEB1

3、8蛋白在細(xì)胞內(nèi)能夠相互結(jié)合。成功構(gòu)建了人核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl及人黑色素瘤相關(guān)抗原MAGEB18攜帶有標(biāo)簽蛋白的突變體，并且成功地在293T細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。并且鑒定出了TNIPl以及MAGEB18的相互結(jié)合位點(diǎn)分別位于311535aa與114284aa，使用半定量WesternBlotting驗(yàn)證了TNIPl與MAGE—B18可以發(fā)生協(xié)同作用，從而影響核因子KB的活化。同時(shí)使用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了TNIPl與MAGEB18發(fā)生協(xié)同作

4、用后可以抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)論：黑色素瘤相關(guān)抗原MAGEB18可以與人核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用。同時(shí)這兩種蛋白可以發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，從而抑制核因子KB活化。同時(shí)，在這兩種蛋白的共同作用下可以顯著抑制由于NFrB活化所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。這為我們進(jìn)一步研究MAGEB18以及TNIPl在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。。關(guān)鍵詞：腫瘤；黑色素瘤相關(guān)抗原；MAGEB18；TNIPI；NFxB目錄弓l言1第l章實(shí)驗(yàn)材料與方法411材

5、料4111主要儀器設(shè)備”4112質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株4113主要實(shí)驗(yàn)試劑512方法”5121MAGEB18與TNIPl相互作用的研究5122表達(dá)MAGEB18與TNIPl突變體的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)10123TNIPl與MAGEBl8作用位點(diǎn)的鑒定124MAGEBl81與TNIPl作用位點(diǎn)的鑒定192013MAGEB18與TNIPl對(duì)核因子KB(NFKB)調(diào)控的研究20131MAGEB18與TNIPl對(duì)核因子KB(NF—KB)下游轉(zhuǎn)錄