黑色素瘤相關抗原MAGE-A家族在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義.pdf

1、惡性腫瘤是我國主要的公共健康問題，其中喉癌（laryngeal carcinoma, LC）是我國最常見的頭頸部惡性腫瘤，而喉癌以其日益增高的發(fā)病率，也逐漸引起廣泛關注。喉癌的治療包括手術治療，放療和化療。然而，復發(fā)和轉移比較常見，且預后仍不理想。因此需要迫切尋求一種新的方法治療喉癌患者。黑色素瘤相關抗原（Melanoma antigen，MAGE）-A屬于癌睪丸抗原（Cancer/testis antigens，CTA），高表達于多種

2、腫瘤組織，而在除干細胞外的正常人體組織中均不表達。
　　本課題組一直致力于MAGE-A家族在腫瘤中表達及意義的研究。而MAGE-A家族在喉鱗狀細胞癌病人的表達模式仍不明。本研究利用免疫組織化學法分別檢測MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、MAGE-A9和MAGE-A11在喉鱗狀細胞癌組織、相應正常黏膜組織中的表達及與其臨床生物學指標和預后之間的關系。我們進一步通過甲基化特異性P

3、CR（Methylation specific polymerase chain reaction， MSP）的方法檢測了106例 LSCC組織及22例相應的癌旁正常組織中MAGE-A1和 MAGE-A3的甲基化水平，采用免疫組化法對這些組織中DNA甲基轉移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達情況進行了研究。并通過多重巢式 RT-PCR（Multiple nested RT-PCR）檢測 MAGE-A基因在喉鱗狀細胞癌外周血中

4、的 mRNA水平，從而為MAGE-A家族成為喉鱗狀細胞癌預后監(jiān)測的特異性指標提供理論依據(jù)。主要研究內容和結果如下：
　　第一部分 MAGE-A家族在喉鱗狀細胞癌組織中的表達情況及臨床意義
　　目的：
　　探討黑色素瘤相關抗原 MAGE-As、-A9和-A11在喉鱗狀細胞癌組織，相應正常組織中的表達及與其臨床生物學指標之間的關系，特別是預后意義。
　　方法：
　　1應用免疫組織化學法在睪丸組織中驗證 MAGE

5、-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、-A9和-A11的特異性。
　　2應用免疫組織化學法檢測106例LSCC組織中MAGE-As、-A9和-A11蛋白的表達，分別用卡方檢驗，Kaplan-Meier生存分析以及Cox回歸分析檢測蛋白表達與患者臨床生物學指標及其預后的關系。
　　結果：
　　1 MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A

6、12）蛋白正常睪丸組織和LSCC中均有表達。在正常睪丸組織中尤其精原細胞和精母細胞核中均顯著表達。MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白在癌組織中主要定位于細胞質，部分定位于細胞核。106例正常黏膜組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白表達， LSCC組織中 MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、

7、-A6、-A10和-A12）的陽性率為54.72％（58/106）。
　　在LSCC組織中，MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白表達與LSCC患者的年齡、性別、吸煙量、臨床分型、組織學分級均無相關性（P>0.05）但與臨床分期、腫瘤大小和淋巴轉移（P＜0.05）呈正相關。
　　2 MAGE-A9蛋白正常睪丸組織和LSCC組織中均有表達。在正常睪丸組織中尤其精原細胞和精母

8、細胞核中均顯著表達。MAGE-A9蛋白在癌組織中主要定位于細胞質，部分定位于細胞核。106例正常粘膜組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-A9蛋白表達，LSCC組織中MAGE-A9的陽性率為46.22%（49/106）。
　　在LSCC組織中，MAGE-A9蛋白表達與LSCC患者的年齡、性別、吸煙量、臨床分型、組織學分級均無相關性（P>0.05）但與臨床分期、腫瘤大小和淋巴轉移（P＜0.05）呈正相關。
　　3 MAGE-A11蛋白正常睪丸

9、組織和LSCC組織中均有表達。在正常睪丸組織中尤其精原細胞和精母細胞核中均顯著表達。MAGE-A11蛋白在癌組織中主要定位于細胞質，部分定位于細胞核。106例正常黏膜組織中未發(fā)現(xiàn) MAGE-A11蛋白表達，LSCC組織中 MAGE-A11的陽性率為51.89%（55/106）。
　　在LSCC組織中，MAGE-A11蛋白表達與臨床分期和腫瘤大?。≒＜0.05）呈正相關，MAGE-A11蛋白與LSCC患者的年齡、組織學分級、淋巴轉移

10、均無相關性（P>0.05）。
　　4106例LSCC組織標本中，MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）、-A9和-A11蛋白表達呈均勻分布，三種蛋白同時表達的有35例，占33.02%（35/106）。106例LSCC中三種蛋白陽性表達率之間無明顯差異（χ2=1.585，P＝0.453）。
　　5 LSCC患者表達MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A

11、6、-A10和-A12）, MAGE-A9, MAGE-A11陽性的患者的總生存期比其表達陰性的患者低。多因素分析106例LSCC患者的生存率，統(tǒng)計結果顯示，年齡，性別，織學分級，腫瘤分型，吸煙與生存率均無明顯相關性（P>0.05），而MAGE-As（包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12）蛋白高表達，MAGE-A9蛋白高表達，MAGE-A11蛋白高表達，臨床分期，淋巴結轉移，腫瘤大小與生存率相關（P<0

12、.05）。Cox回歸模型分析表明MAGE-A9蛋白表達是LSCC患者預后差的獨立因素。
　　結論：
　　MAGE-As，-A9，-A11是 LSCC的腫瘤相關性抗原，可成為 LSCC免疫治療的理想抗原。此外，MAGE-A9可作為LSCC患者預后不良的指標。
　　第二部分 MAGE-A家族在喉鱗狀細胞癌中表達的表觀遺傳學機制
　　目的：
　　探討LSCC及相應癌旁正常組織中MAGE-A1和MAGE-A3的甲基

13、化水平，并分析其甲基化與對應標本中MAGE-A家族表達水平的關系。同時探討了甲基轉移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在LSCC組織中的表達，并分析了其表達與標本中MAGE-A1和MAGE-A3甲基化狀態(tài)及其與MAGE-A家族表達的相關性。
　　方法：
　　通過MSP方法檢測了106例LSCC組織及22例相應的癌旁正常組織中MAGE-A1和MAGE-A3的甲基化水平，采用免疫組化法對這些組織中DNA甲基轉移酶DNMT1

14、、DNMT3a和DNMT3b的表達情況進行了研究，MAGE-A1和MAGE-A3的甲基化采用χ2檢驗或Fisher’s檢驗進行統(tǒng)計。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達與MAGE-A甲基化狀態(tài)及MAGE-A表達之間的關系采用χ2檢驗或 Fisher’s檢驗進行統(tǒng)計，相關性采用Spearman相關性檢驗。
　　結果：
　　1 MAGE-A1基因在LSCC組織中的非甲基化率為39.6%（42/106）。22例癌旁正常組織

15、中MAGE-A1基因均為甲基化狀態(tài)。
　　2 MAGE-A3基因在LSCC組織中的非甲基化率為46.2%（49/106）。22例癌旁正常組織中MAGE-A3基因均為甲基化狀態(tài)。
　　3 MAGE-A1和 MAGE-A3基因啟動子區(qū)去甲基化狀態(tài)與整個MAGE-A家族的蛋白表達水平有顯著正相關(r=0.388，P=0.000)(r=0.387， P=0.000)。
　　4在LSCC組織中，DNMT1、DNMT3a和DNMT

16、3b蛋白的陽性染色主要定位于細胞核。106例LSCC組織中有37例DNMT1蛋白表達陽性，陽性率為34.91%；40例DNMT3a蛋白表達陽性，陽性率為37.74%；35例DNMT3b蛋白表達陽性，陽性率為33.02%。
　　LSCC組織中 MAGE-A1的去甲基化水平與甲基轉移酶 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達呈負相關關系（χ2=13.017，r=-0.350，P=0.000）（χ2=19.755， r=-0.43

17、2， P=0.000）（χ2=11.038， r=-0.323， P=0.001）。MAGE-A3的去甲基化水平與甲基轉移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達也呈負相關關系（χ2=22.490，r=-0.480，P=0.000）（χ2=21.327， r=-0.449，P=0.000）（χ2=14.459，r=-0.369，P=0.000）。
　　LSCC組織中 MAGE-As的表達與 DNA甲基轉移酶 DNMT1、DN

18、MT3a和 DNMT3b的表達均呈負相關關系（χ2=25.127，r=-0.487， P=0.000）（χ2=19.206， r=-0.426， P=0.000）（χ2=21.406， r=-0.449， P=0.000）。
　　5 Eca109細胞中MAGE-As表達陽性，Hep-2中MAGE-As表達陰性。
　　6 RT-PCR結果顯示，未經藥物處理的 Hep-2細胞未見 MAGE-As mRNA的表達。應用2.5μmo

19、l/L、5μmol/L5-aza-CdR分別作用細胞72小時后可見MAGE-As基因重新表達，隨著藥物濃度增高，MAGE-As基因表達增強。
　　結論：
　　DNA甲基轉移酶DNMT家族通過參與MAGE-A家族的甲基化過程調控MAGE-A基因的表達，在LSCC的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　第三部分喉鱗狀細胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞中MAGE-A基因的表達
　　目的：
　　探討 MAGE-A基因在

20、LSCC外周血循環(huán)腫瘤細胞中的表達及與預后的相關性。
　　方法：
　　采用多重巢式 RT-PCR（multiplex nested RT- PCR）方法檢測65例LSCC患者和30例健康人外周血中 MAGE-A基因的 mRNA表達水平，并利用酶切的方法鑒定該家族成員 MAGE-A1、-A2、-A3、-A4和-A6的表達情況。同時利用普通 RT-PCR方法檢測 MAGE-A9和 MAGE-A11基因的表達情況。
　　結果

21、：
　　1 MAGE-A基因在LSCC患者外周血中表達率為29.23%（19/65）。應用每一種基因所對應的限制性內切酶 Bcl I、EcoRI、Eco47 III、Sph I和Afl III進行酶切實驗，觀察到MAGE-A基因在LSCC外周血中的表達順序為 A2>A3>A1>A4>A6。MAGE-A1的表達率為16.90%（11/65）， MAGE-A2的表達率21.54%(14/65)，MAGE-A3的表達率為20%(13/6

22、5)， MAGE-A4的表達率為15.38%(10/65)， MAGE-A6的表達率為13.85%(9/65)，MAGE-A9的表達率為18.46%(12/65)，MAGE-A11的表達率為23.08%(15/65)。17（17/65）個 LSCC患者外周血只表達一種MAGE-A基因，11（11/65）個LSCC患者外周血表達兩種 MAGE-A基因，8（8/65）個LSCC患者外周血表達三種 MAGE-A基因，0（0/65）個 LSCC

23、患者外周血同時表達四種 MAGE-A基因，5（5/65）個 LSCC患者外周血同時表達五種MAGE-A基因，3（3/65）個LSCC患者外周血表達六種 MAGE-A基因，其中2（2/65）個LSCC患者外周血中同時表達七種 MAGE-A基因。
　　2 MAGE-A基因的表達與多個臨床指標存在相關性。MAGE-A2基因的表達率隨 LSCC患者腫瘤大小的增加而增加（χ2=4.916，P=0.027）。MAGE-A9基因的表達率隨LSC

24、C患者腫瘤大小的增加而增加（χ2=7.304， P=0.007）。MAGE-A6基因的表達率隨LSCC患者組織學分級的增加而增加（χ2=4.746，P=0.029）。存在淋巴結轉移的LSCC患者 MAGE-A基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=17.868，P=0.000）。存在淋巴結轉移的LSCC患者MAGE-A1基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=10.943，P=0.001）。存在淋巴結轉移的LSCC患者MAG

25、E-A2基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=13.848，P=0.000）。存在淋巴結轉移的LSCC患者MAGE-A3基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=16.250，P=0.000）。存在淋巴結轉移的LSCC患者MAGE-A4基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=13.446，P=0.000）。存在淋巴結轉移的 LSCC患者 MAGE-A6基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=16.565， P=0

26、.000）。存在淋巴結轉移的 LSCC患者MAGE-A9基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=18.092，P=0.000）。存在淋巴結轉移的LSCC患者MAGE-A11基因的表達率顯著高于非淋巴結轉移的患者（χ2=21.262，P=0.000）。MAGE-A基因的表達率隨 LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=5.311，P=0.021），MAGE-A1基因的表達率隨LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=6.237，P=0

27、.013）， MAGE-A2基因的表達率隨LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=6.032， P=0.014），MAGE-A11基因的表達率隨 LSCC患者臨床分期的遞增而增加（χ2=10.543，P=0.001）。MAGE-A基因的表達率隨LSCC患者吸煙量增加而增加（χ2=5.831，P=0.016）。MAGE-A2基因的表達率隨LSCC患者吸煙量增加而增加（χ2=4.406，P=0.036）。MAGE-A3基因的表達率隨LSCC