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文檔簡介
1、目的:多種因素影響惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展,包括環(huán)境因素、遺傳因素和種族因素等都扮演重要角色。大量臨床、流行病學(xué)及遺傳學(xué)研究揭示,惡性黑色素瘤屬于異質(zhì)性腫瘤,包含多種基因突變類型,可在陽光暴露程度不同的身體多部位發(fā)病,提示其發(fā)生受多致病因素影響。利用現(xiàn)代先進(jìn)的基因檢測技術(shù),深入研究惡性黑色素瘤發(fā)病的分子機制,將有助于判斷疾病預(yù)后和選擇最佳治療方案。
表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)和表皮生
2、長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)是參與正常細(xì)胞和異常細(xì)胞分裂、增殖、遷移和存活的關(guān)鍵分子。EGFR與配體結(jié)合后可發(fā)生同源或異源二聚體化,導(dǎo)致其胞內(nèi)段受體酪氨酸激酶發(fā)生自身磷酸化,主要通過ERK、Akt和JNK通路傳導(dǎo)活化信號。當(dāng)其異常活化或降解抑制時,可導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生。有研究證明,許多人類腫瘤中均過表達(dá)EGFR,且EGFR的表達(dá)水平與治療反應(yīng)不佳、疾病惡化及存活率
3、低相關(guān)。
細(xì)絲蛋白A(FilaminA,F(xiàn)LNa)是第一個在非肌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的肌動蛋白結(jié)合蛋白。其可形成同源二聚體,與肌動蛋白交聯(lián)構(gòu)成動態(tài)三維立體結(jié)構(gòu)。FLNa作為腳手架可錨定90余種伴侶分子,其中包括多種細(xì)胞膜受體,調(diào)控諸如細(xì)胞形狀、細(xì)胞移動、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞功能和生理過程。最近研究發(fā)現(xiàn),腫瘤發(fā)生不僅與EGFR持續(xù)活化、蛋白降解抑制有關(guān),并且與FLNa構(gòu)成的復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)有關(guān),可由于FLNa異常表達(dá)影響其與伴侶錨定聯(lián)接,
4、導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。盡管已證實FLNa與導(dǎo)致惡性腫瘤的信號異常有關(guān),但其具體機制仍有待研究。
我們利用不表達(dá)FLNa的人惡性黑色素瘤M2細(xì)胞株和經(jīng)FLNa基因轉(zhuǎn)染M2細(xì)胞獲得的穩(wěn)定表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞進(jìn)行的實驗結(jié)果顯示,雖然M2細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)量明顯高于M2A7細(xì)胞,但經(jīng)EGF刺激后EGFR磷酸化的量卻明顯少于M2A7細(xì)胞。此結(jié)果提示,EGFR表達(dá)量的多少并不代表其活化程度,可能還有其它因素調(diào)控著EGFR的活化,臨床上不能
5、僅僅根據(jù)EGFR的表達(dá)量來評價腫瘤患者的預(yù)后,研究調(diào)控EGFR活化的新機制具有重要的理論和實用價值。
為此,本實驗擬通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),改變?nèi)藧盒院谏亓黾?xì)胞FLNa的表達(dá)水平,觀察FLNa表達(dá)變化對惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響;接種裸鼠,觀察FLNa表達(dá)變化對惡性黑色素瘤細(xì)胞成瘤能力的影響;通過蛋白印跡(western blot)及免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)檢測FLNa表達(dá)變化對EGFR
6、及其下游信號磷酸化水平的影響;收集臨床資料,觀察人惡性黑色素瘤組織中FLNa表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。以期揭示FLNa與惡性黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制,為FLNa成為惡性黑色素瘤臨床診斷參考指標(biāo)和基因治療新靶點等提供理論依據(jù)。
方法:
1.FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞株增殖、遷移及侵襲的影響體外培養(yǎng)不表達(dá)FLNa的人惡性黑色素瘤M2細(xì)胞及其穩(wěn)定表達(dá)FLNa的亞克隆M2A7細(xì)胞;將表達(dá)FLNa-shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)
7、FLNa的人惡性黑色素瘤UACC647細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞,利用western blot驗證沉默效果。
1.1 體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響利用MTT法體外檢測FLNa對細(xì)胞活力的影響。實驗細(xì)胞分別接種于96孔板,血清饑餓4小時后,加入不同濃度EGF(4,20,100 nM)培養(yǎng)44小時,加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時,棄去上清液,加入DMSO振蕩溶解后置于酶
8、標(biāo)儀570nm處檢測OD值。
利用平板克隆法體外檢測FLNa對細(xì)胞貼壁后克隆形成的影響。實驗細(xì)胞吹打混勻為單細(xì)胞懸液后分別接種于35mm培養(yǎng)皿,在含1%或10%胎牛血清培養(yǎng)基及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周,蘇木素染色后,鏡下觀察并計數(shù)克隆形成數(shù)量。
利用軟瓊脂克隆法體外檢測FLNa對細(xì)胞非錨定增殖的影響。用含0.35%低熔點瓊脂糖的培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液后,分別接種于預(yù)先鋪有含0.6%瓊脂糖培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板,在含1%或1
9、0%胎牛血清及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周,鏡下觀察并計數(shù)克隆形成數(shù)量。
1.2 利用劃痕法體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞遷移的影響實驗細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板并饑餓培養(yǎng)4小時。使用無菌移液器吸頭在單層細(xì)胞上均勻劃痕,漂洗脫落細(xì)胞。無或加入EGF(20nM)繼續(xù)培養(yǎng),定時觀察并拍照記錄至劃痕愈合,以劃痕初始寬度為1計算各時間點相對寬度值。
1.3 利用Transwell小室法體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞侵
10、襲的影響預(yù)饑餓的實驗細(xì)胞分別置于Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清MEM或1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后,上室未穿膜細(xì)胞用棉簽擦去,已穿膜細(xì)胞用甲醇固定、HE染色,光鏡觀察并拍照計數(shù)。
2.FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞EGFR信號通路分子的影響預(yù)饑餓細(xì)胞分別接受EGF(20 nM)刺激0、5、10、30分鐘,加入蛋白裂解液提取總蛋白。將等濃度等體積蛋白樣本經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。利用3%牛血清白蛋白或5%脫脂奶
11、粉封閉PVDF膜,分別加入抗磷酸化酪氨酸、EGFR、磷酸化ERK、總ERK和β-actin等一抗,4℃過夜,次日加入相應(yīng)二抗,曝光顯影,使用ImageJ軟件定量分析蛋白條帶灰度值。
裂解實驗細(xì)胞,向蛋白裂解液分別加入小鼠抗EGFR抗體和小鼠IgG于4℃過夜?jié)L動混勻。次日加入蛋白G瓊脂糖微珠滾動混勻。漂洗微珠后,經(jīng)加熱獲取洗脫液,用抗磷酸化酪氨酸抗體進(jìn)行western blot檢測。
3.FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞裸
12、鼠體內(nèi)成瘤的影響將UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞分別接種于5周齡雌性BALB/c裸鼠右后肢。成瘤后每周2次測量瘤體直徑并稱重。4周后處死裸鼠,剝?nèi)×鼋M織并稱重拍照。提取瘤組織總蛋白,利用western blot檢測不同瘤組織EGFR磷酸化水平。石蠟包埋瘤組織,免疫組織化學(xué)法檢測FLNa及Ki-67表達(dá)。兩位病理學(xué)家獨立判斷FLNa和Ki-67的表達(dá)情況。采用H指數(shù)法半定量分析FLNa表達(dá);統(tǒng)計500個腫瘤細(xì)胞內(nèi)K
13、i-67表達(dá)情況,計算其陽性表達(dá)率。
4.FLNa和Ki-67在人惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)從白求恩國際和平醫(yī)院病理科選取30例惡性黑色素瘤組織標(biāo)本,采用免疫組化計數(shù)分別檢測FLNa和Ki-67的表達(dá)情況,并分析FLNa的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。
結(jié)果:
1.FLNa促進(jìn)入惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲通過穩(wěn)定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)得到沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞株。蛋白印跡法檢測,與親本細(xì)胞組
14、及陰性對照組相比,UACC647(KD)細(xì)胞FLNa的表達(dá)被抑制70%以上。
通過MTT實驗檢測,在不同濃度EGF(4nM,20nM,100 nM)刺激下,與不表達(dá)FLNa的M2細(xì)胞相比,表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞均展示出更高的增殖能力;但是在無EGF刺激情況下,兩者增殖能力基本相同。類似的是,隨著將UACC647細(xì)胞FLNa沉默表達(dá),在有或無EGF刺激下,其增殖能力均有所降低。平板克隆形成及軟瓊脂克隆形成實驗均顯示,在EGF
15、刺激下,F(xiàn)LNa表達(dá)水平較高的M2A7和UACC647(ctrl)細(xì)胞形成克隆的能力均強于FLNa表達(dá)水平較低的M2和UACC647(KD)細(xì)胞。
通過劃痕實驗檢測,在有或無EGF刺激下,高表達(dá)FLNa的M2A7和UACC647(ctrl)細(xì)胞遷移能力均強于相應(yīng)低表達(dá)FLNa的M2和UACC647(KD)細(xì)胞;其中在EGF刺激下,劃痕后12小時M2A7細(xì)胞的劃痕相對寬度值為0,而M2細(xì)胞劃痕相對寬度值為0.58±0.03;劃痕
16、后15小時UACC647(ctrl)細(xì)胞的劃痕相對寬度值為0,而UACC647(KD)細(xì)胞劃痕相對寬度值為0.51±0.01。
通過Transwell小室實驗檢測,與M2細(xì)胞相比,表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞穿透Matrigel基質(zhì)膠的侵襲能力約是其1.9倍(P<0.01)。與此一致的是,沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞的侵襲能力較UACC647(ctrl)細(xì)胞降低了1.8倍(P<0.01)。
2.FLNa
17、對人惡性黑色素瘤細(xì)胞配體誘導(dǎo)的EGFR信號通路的影響通過Western blot檢測,雖然不表達(dá)FLNa的M2細(xì)胞表達(dá)更多的EGFR,但EGF刺激后磷酸化EGFR水平卻明顯低于表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞。后續(xù)進(jìn)行的免疫沉淀實驗也得到了類似的結(jié)果。檢測EGFR下游信號通路中ERK磷酸化情況,發(fā)現(xiàn)在EGF刺激下,M2A7細(xì)胞中磷酸化ERK水平明顯高于M2細(xì)胞。在UACC647(ctrl)細(xì)胞和沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞上進(jìn)
18、行的實驗也得到一致的結(jié)果,隨著FLNa表達(dá)水平降低,EGF引起的EGFR和ERK磷酸化水平明顯下降,與UACC647(ctrl)細(xì)胞相比,EGF刺激10分鐘后,UACC647(KD)細(xì)胞磷酸化EGFR比率降低了70%。免疫沉淀實驗也證實了UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞中EGFR磷酸化水平的區(qū)別。與UACC647(ctrl)細(xì)胞相比,沉默F(xiàn)LNa導(dǎo)致EGF引起的UACC647(KD)細(xì)胞磷酸化ERK比率顯著降低1.
19、4倍。由此推斷, FLNa可增強EGF刺激引起的EGFR酪氨酸磷酸化水平,并活化其下游Ras-Raf-MEK-ERK通路。
3.FLNa促進(jìn)入惡性黑色素瘤細(xì)胞裸鼠種植瘤生長通過在裸鼠皮下接種UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。與UACC647(ctrl)相比,沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長明顯減慢。免疫組織化學(xué)法檢測顯示,在UACC
20、647(ctrl)細(xì)胞形成的腫瘤組織中可見彌漫、深染的Ki-67沉著于胞核,而強陽性表達(dá)的FLNa信號分布于胞漿。與此相反的是,UACC647(KD)細(xì)胞形成的瘤組織中僅有弱陽性Ki-67和FLNa表達(dá)。經(jīng)線性統(tǒng)計分析,F(xiàn)LNa的H指數(shù)為64.33±10.59,且與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.88;P<0.01)。western blot檢測顯示,UACC647(KD)細(xì)胞所形成的腫瘤組織中磷酸化EGFR和ERK所占比率分別下降80
21、%和46%。上述結(jié)果支持沉默F(xiàn)LNa抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞體外、體內(nèi)增殖的觀點。
4.FLNa低表達(dá)預(yù)示惡性黑色素瘤患者較好預(yù)后經(jīng)兩位病理學(xué)家獨立分析判斷,30例惡性黑色素瘤標(biāo)本中FLNa表達(dá)的H指數(shù)為69.77±5.17。經(jīng)統(tǒng)計分析,F(xiàn)LNa表達(dá)與Ki-67表達(dá)正相關(guān)(r=0.60;P<0.01),而與總生存期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.45;P=0.013)。選取H指數(shù)中位數(shù)分組,高表達(dá)FLNa組患者的總生存期明顯縮短(中位生存期為
22、594天),顯著低于而低表達(dá)FLNa組患者(中位生存期為1949天;P=0.0011)。然而,本實驗未發(fā)現(xiàn)FLNa表達(dá)與患者年齡、性別和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。
結(jié)論:
1.增加或沉默F(xiàn)LNa的表達(dá)可增強或抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力。
2.沉默F(xiàn)LNa表達(dá)可抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤生長。
3.FLNa可通過增強EGF誘導(dǎo)的EGFR活化(磷酸化)及其下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)
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