PIDD對(duì)電離輻射所致BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、【背景與目的】P53誘導(dǎo)含有死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(PIDD,P53-induced protein with a death domain)作為腫瘤抑制因子P53的靶蛋白之一,在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。但是PIDD在小膠質(zhì)細(xì)胞電離輻射所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)中作用與機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道,本研究旨在探討PIDD在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2)中的表達(dá)及其在電離輻射后炎癥反應(yīng)中的作用與機(jī)制。
　　【方法】1,針對(duì)小鼠來(lái)源的PIDD序列設(shè)計(jì)3

2、條抗PIDD反義寡核苷酸(anti-PIDD-si-RNA,antisense oligonucleotides targeting PIDD mRNA)及其陰性對(duì)照反義寡核苷酸。2,使用帶有GFP熒光蛋白標(biāo)記的空白質(zhì)粒與siRNA共轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后,使用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR淘選出沉默效率最高的anti-PIDD-si-RNA。3,使用沉默效率最高的anti-PIDD-si-RNA及陰性對(duì)照siRNA分

3、別轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞后12小時(shí),以0和32Gy兩個(gè)放射劑量照射BV-2細(xì)胞。4,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞照射后不同時(shí)間點(diǎn)(0h,3h,6h,12h,24h)PIDD及TNF-α,IL-1β(炎癥反應(yīng)因子)的mRNA變化。5,免疫蛋白印跡法(western blotting)檢測(cè)各組細(xì)胞PIDD蛋白,NF-κB蛋白的表達(dá)。6,激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞Iba-1及CD68(小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志蛋白)的表達(dá)。7,transwell小室實(shí)

4、驗(yàn)觀察各組細(xì)胞遷移能力變化。8,電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞照射后超微結(jié)構(gòu)變化。
　　【結(jié)果】1,siRNA轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到50％至60%,anti-PIDD-si-RNA2沉默效率最高。2,BV-2細(xì)胞電離輻射后其PIDD,TNF-α及IL1-β的mRNA水平升高;轉(zhuǎn)染anti-PIDD-si-RNA2的BV-2細(xì)胞較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞,照射后PIDD,TNF-α及IL1-β的mRNA水平明顯下調(diào)。3,BV-2細(xì)胞電離輻射后PIDD蛋

5、白表達(dá)隨著時(shí)間變化(24h內(nèi))先升高后降低,NF-κB蛋白表達(dá)持續(xù)升高;轉(zhuǎn)染anti-PIDD-si-RNA2的BV-2細(xì)胞較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞PIDD的蛋白表達(dá)較對(duì)照組下降,NF-κB蛋白表達(dá)下降。4,BV-2細(xì)胞照射后,Iba-1,CD68表達(dá)明顯增加;轉(zhuǎn)染anti-PIDD-si-RNA2的BV-2細(xì)胞較單純對(duì)照組細(xì)胞,照射后Iba-1,CD68表達(dá)明顯減少。5,照射后BV-2細(xì)胞遷移能力增強(qiáng);轉(zhuǎn)染anti-PIDD-si-RNA