水稻黃單胞編碼HarpinXoo全長(zhǎng)基因及其缺失片段轉(zhuǎn)基因煙草和有關(guān)表型的比較研究.pdf

1、大多數(shù)革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌都存在hrp基因(hypersensitive response andpathogenicity)，其決定病原菌對(duì)感病寄主植物的致病性和非寄主植物的過敏反應(yīng)。Harpin是一類由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌hrp基因編碼的蛋白質(zhì)激發(fā)子，可以激發(fā)煙草過敏性細(xì)胞壞死(hypersensitive cell death，HCD)，誘導(dǎo)植物抗病、抗蟲，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。hrfA(HR function)基因是本實(shí)驗(yàn)室通過PC

2、R方法，從水稻黃單胞細(xì)菌白葉枯致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)JxoⅢ菌株中克隆到的。hrfA全長(zhǎng)420 bp，編碼的harpinXoo具有其它harpin蛋白所共有的生物活性：激發(fā)煙草HR，誘導(dǎo)煙草對(duì)多種病原物的抗性。但是harpinXoo還顯示一些獨(dú)特性：富含甘氨酸(Gly)，同時(shí)也含有半胱氨酸(Cys)，分子量比其它已報(bào)道的harpin都小。本實(shí)驗(yàn)室已成功將hrfA轉(zhuǎn)入煙草、水稻、棉花等

3、作物中，都不同程度地提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗病能力。本實(shí)驗(yàn)室李平通過PCR方法，克隆到hrfA基因的5個(gè)缺失突變基因AB、CD、EF、AD和CF，并在Escherichia coli中表達(dá)得到缺失多肽片段。HarpinXoo N-末端的AB片段仍保持誘導(dǎo)過敏反應(yīng)和抗病性的能力；中部的CD多肽片段失去了誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的能力，但仍可以誘導(dǎo)抗病性，而且當(dāng)CD與其它片段組合時(shí)，可增強(qiáng)它們的活性。所以推測(cè)CD可能在harpinXoo分子與植物相互識(shí)別的

4、過程中起著增強(qiáng)子的作用。因此，深入研究AB和CD兩個(gè)多肽片段的誘導(dǎo)抗病性機(jī)理將是有趣的理論問題。
　　 本研究將hrfA基因及其片段AB，CD分別從pET30a(+)∷hrfA，pET30a(+)∷AB，pET30a(+)∷CD中用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后回收，連接到用這兩個(gè)酶切過的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)基因載體pB-hrf，pB-AB，pB-CD。重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，通過凍融

5、法轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌EHA105。經(jīng)菌落PCR和酶切檢測(cè)后，挑選陽性克隆供轉(zhuǎn)化煙草使用。
　　 采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tobacum cv.Xanthi nc.)，用卡那霉素抗性篩選再生植株。通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)了轉(zhuǎn)化煙草中的靶基因序列及35S啟動(dòng)子序列，對(duì)T1代PCR陽性植株進(jìn)行了PCR-Southern雜交和RT-PCR分析。結(jié)果顯示外源基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因煙草基因組中，并且能在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá).從轉(zhuǎn)hrfA基

6、因和AB片段的煙草中提取的可溶性蛋白注射煙草能引起過敏反應(yīng)，而轉(zhuǎn)CD片段的煙草蛋白則不能。
　　 在相同培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的株高、葉片大小和花期等性狀與受體植株無明顯差異，生長(zhǎng)發(fā)育正常，無肉眼可見的HR。用trypan blue對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因表達(dá)harpinXoo及其AB多肽片段能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生micro-HR，而轉(zhuǎn)基因表達(dá)CD多肽片段不能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生micro-HR?？共⌒澡b定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)hrfA基因