SRBSDV12個基因植物表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻表型初探.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV），是呼腸孤病毒科（Reoviradae）斐濟病毒屬（Fijivirus）的一個暫定新種。該病毒侵染水稻后病株表現(xiàn)矮縮，葉色深綠，葉片基部產(chǎn)生皺褶，莖節(jié)部有倒生須根及莖表瘤突、高節(jié)位分蘗及根系褐化。前人研究發(fā)現(xiàn)SRBSDV全基因組由10條線性dsRNA組成，根據(jù)各片段從大到小分別命名為S1~S10，其中S5、S7和S9分別編碼兩個蛋白其余各片段均編碼一個蛋白。目前，SRBSDV部分基因功能及其致病機理尚

2、未清晰，尤其是病毒蛋白與寄主水稻之間的互作機制方面仍需要更深入的探索。為研究 SRBSDV各基因所編碼蛋白的功能和致病機理，本研究分別構(gòu)建了 SRBSDV12個基因的植物表達載體。利用農(nóng)桿菌介導法，分別獲得由SRBSDV S1和S10編碼的RdRP和CP轉(zhuǎn)水稻植株，并重點對T1代轉(zhuǎn)基因水稻的表型進行觀察和利用 RT-qPCR技術(shù)檢測 CP的相對表達量。取得如下研究結(jié)果：
　　1.克隆了SRBSDV12個編碼基因，構(gòu)建了12個基因的

3、植物表達載體，并獲得了相應(yīng)的工程農(nóng)桿菌。通過RT-PCR，以SRBSDV感病水稻葉組織總RNA為模板，擴增獲得了病毒 S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S6、S7-1、S7-2、S8、S9-1、S9-2和 S10編碼的共12個基因，經(jīng)測序確認后連接到植物表達載體pCambia1302上，獲得各基因的植物表達重組質(zhì)粒，分別命名為 pC1302-P1、pC1302-P3、pC1302-P4、pC1302-P51、pC1302-P52、p

4、C1302-P6、pC1302-P71、pC1302-P72、pC1302-P8、pC1302-P91、pC1302-P92和pC1302-P10，利用電激法將上述重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株中。
　　2.分別獲得了4株轉(zhuǎn)RdRP和6株轉(zhuǎn)CP的水稻植株。以水稻品種“日本晴”胚性愈傷組織為受體，用攜帶植物表達重組質(zhì)粒pC1302-P1和pC1302-P10的農(nóng)桿菌EHA105侵染愈傷組織，經(jīng)過潮霉素抗性篩選，預(yù)分化和分化

5、，生根煉苗等過程分別獲得4株P(guān)1陽性和6株P(guān)10陽性植株，Southern blot檢測外源基因S10均為單拷貝。
　　3.對T1代 P1轉(zhuǎn)基因水稻植株的表型進行觀察發(fā)現(xiàn)，各株系 T1代群體幼苗期時與非轉(zhuǎn)基因水稻表型沒有明顯差異。分蘗期時，部分轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出白化現(xiàn)象。白化植株的心葉表現(xiàn)正常，但其余葉片均有不同程度的白化，且長勢較弱。
　　4.獲得了T1代P10轉(zhuǎn)基因水稻植株，并對其進行了分子檢測和表型觀察。對T1代P1

6、0轉(zhuǎn)基因水稻植株進行PCR檢測，結(jié)果表明，6個株系的外源基因基本均以3:1的比例進行遺傳分離，符合孟德爾單基因遺傳規(guī)律。T1代P10轉(zhuǎn)基因植株幼苗期時與非轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯的表型差異。分蘗期時，部分轉(zhuǎn)基因植株長勢明顯減弱，表現(xiàn)出矮化，分蘗減少等表型。
　　5．建立了轉(zhuǎn)基因水稻病毒CP相對表達量RT-qPCR檢測技術(shù)。利用RT-qPCR技術(shù)，分別在幼苗期、分蘗期和抽穗期對轉(zhuǎn)基因水稻植株的病毒CP的相對表達量進行了檢測，結(jié)果表明，外源