水禽呼腸孤病毒P18蛋白鑒定及其反向遺傳操作平臺(tái)的建立.pdf

1、呼腸孤病毒(Reovirus)在20世紀(jì)60年代初期從人和動(dòng)物的呼吸道或腸道中分離出來(lái)，宿主范圍廣泛，能感染人、脊椎動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、真菌等。禽呼腸孤病毒可以感染雞、火雞、鴿子、鴨等各種禽類(lèi)，其中感染水禽的呼腸孤病毒主要包括番鴨呼腸孤病毒(MDRV)、鵝呼腸孤病毒(GRV)，鴨呼腸孤病毒(DRV)。近幾年，鴨呼腸孤病毒新毒株在水禽養(yǎng)殖業(yè)中不斷被分離，目前已經(jīng)成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的最主要的危害因素之一。
　　DRV為呼腸孤病毒科(Re

2、oviridae)正呼腸孤病毒屬成員，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，直徑約為60～80nn，核酸序列為10個(gè)雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)節(jié)段組成，按照核苷酸序列長(zhǎng)度分為3組:長(zhǎng)基因節(jié)段(L1、L2、L3)，中基因節(jié)段(M1、M2、M3)和小基因節(jié)段(S1、S2、S3、S4)。經(jīng)預(yù)測(cè)， DRV S1基因節(jié)段可能包含3個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀碼框(opening reading frame，ORF)，依次

3、編碼P10蛋白，P18蛋白和σC蛋白。
　　DRV P18蛋白可能是由146個(gè)氨基酸組成的非結(jié)構(gòu)蛋白，分子量大小約為18kDa，經(jīng)典MDRV對(duì)應(yīng)的S4基因節(jié)段只編碼P10蛋白和σC蛋白，ARV的P17蛋白與其他蛋白沒(méi)有序列相似性，能夠不停地在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，從而參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，例如基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控等。DRV P18蛋白是否存在并具有ARVP17蛋白的功能或其他功能，這需要試驗(yàn)探究。
　　本研究采用RT-PC

4、R擴(kuò)增獲得DRV P18基因，將其亞克隆至原核表達(dá)載體pCold-TF，表達(dá)并純化獲得P18重組蛋白。以此重組蛋白為免疫原，制備抗P18的多克隆抗體。Western-blot結(jié)果顯示，該抗體具有良好的免疫原性。以此制備的抗體為一抗，利用IFA和激光共聚焦檢測(cè)DRV感染細(xì)胞后，P18蛋白亞細(xì)胞定位及動(dòng)態(tài)分布。結(jié)果顯示，在病毒感染后6h，P18蛋白在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均能檢測(cè)到，之后P18蛋白的分布以細(xì)胞核為主，在感染后30h，P18蛋白在細(xì)

5、胞核檢測(cè)到，而細(xì)胞漿里未能檢測(cè)到;隨后細(xì)胞崩解。上述結(jié)果為深入探討P18蛋白入核分子機(jī)理提供了線索，為臨床早期診斷提供了依據(jù)。但P18蛋白的功能尚有待深入研究。另外，呼腸孤病毒致病力發(fā)生改變、宿主發(fā)生變化的原因一直沒(méi)有突破性進(jìn)展，缺少DRV反向遺傳操作平臺(tái)是主要的制約因素之一。
　　隨后本研究利用全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的一株呼腸孤病毒TH11株進(jìn)行了全基因序列測(cè)定。通過(guò)RT-PCR的方法獲得全基因組序列后，改造pSK載體

6、，成功克隆出了包含TH11株10個(gè)基因節(jié)段的質(zhì)粒，其中在構(gòu)建M2節(jié)段質(zhì)粒時(shí)，用定點(diǎn)突變的方法，在M2節(jié)段引入HindⅢ酶切位點(diǎn)作為分子標(biāo)簽。將10個(gè)質(zhì)粒使用SDS堿裂解法大提，按照不同濃度同時(shí)共轉(zhuǎn)染進(jìn)入BHK-21細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染72h后，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接SPF雞胚，并盲傳3代，收集雞胚的尿囊液進(jìn)行鑒定，將拯救的病毒命名為rDRV，對(duì)拯救的病毒進(jìn)行RT-PCR、分子標(biāo)簽檢測(cè)，結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)成功拯救了帶有分子標(biāo)簽的水禽呼腸孤病毒，并且命名為r

7、DRV;隨后采用間接免疫熒光(IFA)發(fā)現(xiàn)拯救病毒和親本毒都可以產(chǎn)生綠色熒光，Western-blot結(jié)果顯示拯救病毒和親本毒都可以與σC多抗血清、P18多抗血清產(chǎn)生特異性結(jié)合;動(dòng)物回歸試驗(yàn)證明拯救病毒和親本毒都可以致死雛鴨，;對(duì)拯救毒株rDRV進(jìn)行生長(zhǎng)曲線、蝕斑試驗(yàn)等檢測(cè)，結(jié)果表明拯救病毒rDRV和親本毒DRV具有基本一致的生長(zhǎng)曲線，產(chǎn)生空斑的數(shù)目基本相同，說(shuō)明拯救病毒rDRV與親本毒DRV復(fù)制特性基本一致。
　　綜上所述，本研