農(nóng)桿菌介導法將熱激蛋白基因（hsp101）轉(zhuǎn)入早熟禾.pdf

1、草地早熟禾(Poapratensis L．)屬冷季型草坪草，是溫帶地區(qū)重要的草種之一。它具有色美、抗寒、耐蔭、耐修剪等優(yōu)點，在我國北方地區(qū)多被用于建造草坪。但草地早熟禾也有一些缺點，如易受病蟲危害、不耐炎熱、耐低溫能力差、抗旱力不強等，這極大地限制了草地早熟禾在炎熱地區(qū)的推廣。由于草地早熟禾為兼性無融合生殖方式，采用常規(guī)育種方法培育早熟禾耐熱新品種困難較大。因此，利用基因工程的手段來改良草地早熟禾的耐熱性成為當務(wù)之急。現(xiàn)有的草地早熟禾遺

2、傳轉(zhuǎn)化體系存在著植株再生困難、體細胞無性系變異發(fā)生頻率高以及轉(zhuǎn)化周期長、效率低等缺點，嚴重制約了早熟禾基因工程育種研究的發(fā)展。 本研究首先建立了草地早熟禾叢生芽離體培養(yǎng)體系。該體系是以草地早熟禾種子苗莖尖為外植體，切取莖尖(含胚軸和生長點)在附加0.5mg/L 2.4-D和3.0mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上誘導基部膨大，切下膨大的基部轉(zhuǎn)至附加2.0mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上誘導產(chǎn)生叢生芽，然后將叢生芽轉(zhuǎn)入附加3 0mg/L

3、6.BA和0.07mg/L 2.4-D的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，使叢生芽大量擴增。 以兩個草地早熟禾栽培品種納蘇(Nassau)、Mardona的叢生芽芽尖為受體，通過農(nóng)桿菌介導的方法將來源于玉米、編碼熱激蛋白101(HSP101)的hsp101 基因?qū)氩莸卦缡旌虆采繅K中。取繼代培養(yǎng)5-7天的從生芽切至暴露出芽尖生長點，與農(nóng)桿菌菌液浸染，同時在0.5MPa負壓下處理5min，不吸去芽尖表面多余菌液，將芽尖轉(zhuǎn)移到叢生芽誘導培養(yǎng)基上

4、，黑暗條件下共培養(yǎng)3天，然后將芽尖轉(zhuǎn)移到添加100mg/L頭孢霉素的培養(yǎng)基上抑菌培養(yǎng)20天，再轉(zhuǎn)移到加有6.0mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上連續(xù)篩選3代，每代10天。存活的抗性芽經(jīng)增殖后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，20天后移栽入花盆中。對轉(zhuǎn)化植株進行PcR和PcR-soutllern bIotting分析表明外源基因hsp101已經(jīng)轉(zhuǎn)移到草地早熟禾細胞中。 研究了影響轉(zhuǎn)化效率的因素，發(fā)現(xiàn)侵染時農(nóng)桿菌菌液濃度、As的誘導、真空滲入處理及處理