農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗筒说难芯?pdf

1、該試驗以甘藍(lán)型(B.napus)油菜"加拿大雙低(B1)"、芥菜型(B.juncea)油菜"瀘洲四陵"(B2)、白菜型油菜(B.campestris)"浠水白"(B3)為受體材料,試圖建立最佳的油菜再生系統(tǒng),在采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗筒说难芯窟^程中探索高效油菜農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系.結(jié)果如下:(1)觀察對比三個品種B1、B2、B3的子葉(帶0.1-0.2cm柄)、下胚軸、葉盤、莖段分別在多種培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生情況,

2、結(jié)果表明:①油菜不同外植體的愈傷誘導(dǎo)及分化能力差異較大,下胚軸的愈傷誘導(dǎo)及分化能力最強(qiáng),子葉(帶0.1-0.2cm柄)次之,葉盤再次之,莖段最差;②油菜的愈傷組織誘導(dǎo)、分化能力及植株再生能力具有很強(qiáng)的基因型差異性,B2最佳外植體的愈傷誘導(dǎo)及分化能力強(qiáng)于B1、B3.(2)通過對比觀察B1、B2、B3最佳外植體在不同激素配比的多種培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況,確定用于B1、B2、B3植株再生的最佳分化培養(yǎng)基分別為:,B1:MS+6-BA

3、 1mg/L+NAA 0.1mg/L+2,4-D 0.5mg/L,B2:MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+2,4-D 1mg/L,B3:MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+2,4-D 1mg/L,(3)基于建立的優(yōu)化好的植株再生體系,用含有chitinase基因和bar基因的雙元表達(dá)載體pCAMBAR.CHI.11的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化油菜,對各項轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化,確定農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化油菜品種B1、B

4、2、B3外植體的最佳條件為:外植體預(yù)培養(yǎng)2天,用OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌液浸染外植體30s左右,共培養(yǎng)2天后除菌,恢復(fù)培養(yǎng)B1、B3以14-17天為宜,B2以10-14天為宜,加選擇壓進(jìn)行篩選.同時發(fā)現(xiàn),乙酰丁香酮(AS)對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化油菜有很明顯的促進(jìn)作用.(4)轉(zhuǎn)化后經(jīng)潮霉素、Bastar篩選獲得了油菜抗性苗,通過PCR驗證,初步證明得到了含外源chitinase基因的轉(zhuǎn)基因植株.(5)12株P(guān)CR陽性植株經(jīng)Southern雜交驗