神經(jīng)生長因子對SCG神經(jīng)元興奮性以及M電流和Na電流調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、鑒于M通道、Na通道和NGF均具有重要的生理和病理生理意義，本實(shí)驗(yàn)以分離培養(yǎng)的大鼠頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SuperiorCervicalGanglionneurons，SCGneurons)為平臺，觀察了NGF對神經(jīng)元興奮性的影響以及NGF對M通道和Na通道的作用，初步探討了NGF對二者產(chǎn)生作用的分子機(jī)制。 目的：分離培養(yǎng)大鼠SCG神經(jīng)元，利用膜片鉗技術(shù)記錄神經(jīng)元動作電位和通道電流，(1)觀察NGF對SCG神經(jīng)元興奮性的影響；(2)

2、確定NGF是通過作用于何種離子通道進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性；(3)初步探討NGF對離子通道作用的機(jī)制。 方法：(1)SCG神經(jīng)元的分離與培養(yǎng)：取4-6周齡的SD雄性大鼠，迅速摘取其頸上神經(jīng)節(jié)，經(jīng)過剪切、消化、洗酶、重懸、種植等過程，生化培養(yǎng)箱37℃，5％CO2+95％混合氣，培養(yǎng)1d后用于膜片鉗記錄。2d內(nèi)做完。要求：無菌，低溫，操作迅速。(2)電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)：利用打孔膜片鉗技術(shù)和全細(xì)胞膜片技術(shù)，記錄神經(jīng)元動作電位和離子通道電流，急性

3、給予NGF，觀察NGF對神經(jīng)元興奮性和通道電流的作用并分析其作用機(jī)制。要求：①相同條件的灌流給藥和②嚴(yán)格有效的實(shí)驗(yàn)對照。 結(jié)果：(1)短時間內(nèi)(～2min)應(yīng)用NGF，能增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性，表現(xiàn)為動作電位頻率升高；延長NGF應(yīng)用時間(～10min)，反而抑制神經(jīng)元興奮性，表現(xiàn)為動作電位頻率降低。長時間沖洗NGF后，興奮性沒有恢復(fù)或很難恢復(fù)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，短時間內(nèi)應(yīng)用NGF使神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)1.6倍；而長時間應(yīng)用NGF可使神經(jīng)元興奮

4、性降低至原來的43％。二者分別與對照相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)急性應(yīng)用(～2min)NGF能迅速抑制M電流，抑制率達(dá)42.8％±3.8％(n=6)，其電流抑制的特征頗類似于乙酰膽堿對M電流的抑制；長時間沖洗NGF后，M電流沒有(或很難)從抑制作用中恢復(fù)，這與乙酰膽堿對M電流的抑制有區(qū)別。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)用NGF前后相比，二者之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。(3)預(yù)先應(yīng)用(電極內(nèi)應(yīng)用)TrkA受體的特異性阻斷劑AG879，待其擴(kuò)散3-5min后

5、，再給予NGF。觀察發(fā)現(xiàn)AG879可明顯降低NGF對M電流的抑制作用，使其抑制率從42.8％±3.8％(n=6)降至17％±3.1％(n=7)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在AG879存在情況下應(yīng)用NGF和對照相比，二者之間有統(tǒng)計學(xué)差異。(4)預(yù)先應(yīng)用磷脂酶C(PLC)的抑制劑U73122，再給予NGF。觀察發(fā)現(xiàn)U73122能顯著消弱NGF對M電流的抑制作用，使其抑制作用從40.9％±6.9％(n=5)降低至12.2％±4.6％(n=5)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表

6、明，在U7312存在情況下應(yīng)用NGF和對照相比，二者之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。(5)預(yù)先應(yīng)用酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein，在其存在的情況下，再給予NGF。觀察發(fā)現(xiàn)Genistein可明顯減弱NGF對M電流的抑制作用，使其抑制率從33.4％±3.2％(n=5)降至7.4％±4.1％(n=7)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在Genisten存在情況下應(yīng)用NGF和對照相比，二者之間有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。(6)急性灌流NGF(～10min)，可顯著抑制

7、Na電流，抑制率達(dá)41.5％±6.2％(n=7)；與其抑制M電流相比，有相對緩慢和明顯延遲的特征。給予NGF后，一般在2min后才發(fā)揮抑制作用，而且長時間沖洗NGF后，Na電流沒有(或很難)從抑制中恢復(fù)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)用NGF前后相比，二者之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。藥理學(xué)鑒定顯示，SCG神經(jīng)元的Na電流是一種TTX敏感型Na電流，因TTX可完全抑制之。(7)預(yù)先給予酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein，再應(yīng)用NGF。觀察發(fā)現(xiàn)Genis

8、tein可顯著減弱NGF對神經(jīng)元Na電流的抑制作用，使其抑制率從41.5％±6.2％(n=7)降至15.8％±11.2％(n=3)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在Genisten存在情況下應(yīng)用NGF和對照相比，二者之間有統(tǒng)計學(xué)差異。值得注意的是，Genistein本身對SCG神經(jīng)元Na電流有強(qiáng)烈的抑制作用，沖洗后還能迅速恢復(fù)。(8)M受體激動劑oxotremorinemethiodide(oxo-M)，也能活化PLC引起膜磷脂PIP2的水解和下游信號

9、蛋白PKC的激活。給予oxo-M(～10min)對SCG神經(jīng)元Na電流沒有作用，這和前人的工作有所不同。前人的工作提示，在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，乙酰膽堿通過M受體激活下游信號蛋白PKC，PKC可通過將神經(jīng)元Na通道(Nav1.2)的第1506位絲氨酸磷酸化而抑制Na電流。(9)預(yù)先給予酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein，再應(yīng)用NGF，Genistein取消了NGF對神經(jīng)元興奮性的影響。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在Genistein存在的情況下，應(yīng)

10、用NGF前后相比，神經(jīng)元興奮性的變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異。有趣的是，Genistein本身可強(qiáng)烈抑制神經(jīng)元興奮性，使動作電位發(fā)放次數(shù)見明顯減少，這可能因其強(qiáng)烈抑制Na電流所致。 結(jié)論：(1)NGF對SCG神經(jīng)元興奮性有雙重調(diào)節(jié)作用。表現(xiàn)為NGF短時間內(nèi)(～2min)增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性，長時間內(nèi)(～10min)抑制神經(jīng)元興奮性。(2)NGF對SCG神經(jīng)元M電流的急性(～2min內(nèi))抑制作用，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性的增強(qiáng)。(3)NGF對M電流的抑

11、制作用，是通過其特異性受體TrkA介導(dǎo)產(chǎn)生的。(4)NGF激活的兩個細(xì)胞內(nèi)過程——PLC介導(dǎo)的膜磷脂PIP2的水解和酪氨酸磷酸化作用——參與了NGF對M電流的抑制。(5)NGF對SCG神經(jīng)元Na電流的抑制作用，導(dǎo)致興奮性的抑制。此Na電流是TTX敏感性Na電流，因TTX可完全抑制之。(6)NGF激活的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化作用參與了NGF對Na電流的抑制，而PLC介導(dǎo)的膜磷脂PIP2的水解及其下游效應(yīng)器酶PKC沒有參與此作用。(7)藥理學(xué)阻