背根節(jié)神經元的興奮性分型與Reluzole對INaP的抑制作用.pdf

1、神經病理性痛是指外傷、缺血、中毒或者機體代謝異常造成的神經病理性損傷，以痛覺過敏、觸誘發(fā)痛、感覺倒錯以及自發(fā)性疼痛為主要表現。背根節(jié)(DorsalRootGanglion,DRG)神經元是初級感覺神經元胞體的集合，是外周感覺傳入的中轉站。生理情況下，其主要功能是將神經末梢感受器換能產生的動作電位信息忠實的傳遞至脊髓，從而保證信息的完整性。然而在某些病理性條件下，如DRG受到直接或間接損傷后，神經元胞體將出現興奮性的異常增高，產生形式多樣

2、的異位自發(fā)放電活動。該放電已被證明是產生多種異常疼痛感覺的慢性痛信號。
　　興奮性是指可興奮細胞受到刺激時產生動作電位(actionpotential，AP)的能力，傳統(tǒng)觀念以閾值高低或產生AP的多少衡量興奮性的高低。損傷造成的DRG興奮性的變化，從傳統(tǒng)的電生理檢測角度觀察，有閾值與適應性的變化，而基于Hodgkin-Huxley的理論，亦可表現為興奮性類型的變化。Hodgkin于1948年在青蟹神經軸突上發(fā)現神經元興奮性按照其刺

3、激電流強度與放電頻率之間的關系可分為三種類型[1]。第一種類型對注入電流非常敏感，第二種類型在電流強度增加時放電頻率保持恒定并維持在較高水平，第三種放電類型在較高的刺激下只產生1-2個放電。我們實驗室既往的工作在三叉神經中腦核神經元證實了這一分類的存在，并對二型神經元的分型標準進行了補充[2]。對于背根節(jié)，我室既往研究發(fā)現DRG神經元具有周期和簇狀放電，并且表現閾下膜電位振蕩活動，損傷后該比例增高。該現象提示，在DRG神經元可能存在著上

4、述興奮性分型的表現。
　　RinzelJ的工作提示，不同類型興奮性的產生是因為神經元經歷了不同的從靜息態(tài)到放電態(tài)的不同動力學分叉[3]。神經元興奮性分型的確定有助于我們了解細胞在外界刺激后發(fā)生怎樣的反應，即細胞對外界信息具有怎樣的編碼作用。同時，神經動力學系統(tǒng)認為，離子電流參數的改變可以導致興奮性類型的轉化。不同興奮性類型神經元所含離子電流成分的比例不同可能導致神經元興奮性的改變。在CCD模型[4]的諸多研究表明，神經元超興奮的發(fā)

5、生與一種慢失活的Na電流，又稱持續(xù)Na電流（INaP）的增多有著密切關系，而CCD模型前后分型比率的變化是否也伴隨著INaP電流的變化，對該問題的闡明有助于我們深入解釋超興奮發(fā)生的本質過程。
　　結果主要包括兩部分:
　　第一部分：背根神經節(jié)（DRG）神經元興奮性的分類與轉型。
　　本文擬對DRG神經元的興奮性特征進行檢測，觀察是否存在上述的興奮性分型的表現，進而在慢性背根節(jié)壓迫神經病痛模型對這一分型比率是否變化進行分

6、析，期望從興奮性分型角度對慢性痛信號的形成作深入探討。既往實驗室在三叉神經中腦核的工作[2]還提示，INaP在細胞興奮性分型乃至分型之間的轉化中有著十分重要的作用，我們隨后的工作即對分型比率變化的可能的離子通道機制進行探討。
　　實驗運用我室創(chuàng)建的背根神經節(jié)慢性壓迫模型（CCD模型），對背根神經節(jié)進行整節(jié)消化后，利用電流鉗及電壓鉗的方法對DRG中、大神經元進行全細胞膜片鉗記錄。
　　結果如下：
　　1.正常DRG神經元

7、的三種興奮性類型：
　　對179個正常DRG神經元施加去極化方波刺激及去極化斜波刺激，觀察到三種不同的興奮性類型。1型興奮性神經元占13％（23/179）：其閾值較低，放電頻率隨著刺激電流強度的增強而線性增加，在去極化斜波刺激條件下，1型神經元的放電頻率隨著膜電位的逐漸去極化由低到高，呈線性增加，動作電位之前沒有出現閾下膜電位振蕩(SMPO)。2型興奮性神經元占27％（48/179）：其閾值相對1型興奮性神經元較高，達到閾值后，動

8、作電位成串出現，放電頻率對刺激電流的強度變化相對不敏感。在去極化斜波刺激條件下，2型神經元在膜電位去極化的過程中出現了SMPO，并在SMPO的基礎上產生動作電位。3型興奮性神經元占60％（108/179）：不僅閾值電流較高，在去極化方波刺激下通常只產生1個AP，而且在去極化斜波刺激條件下，3型興奮性神經元沒有出現AP。
　　2.正常DRG三種興奮性類型神經元的持續(xù)鈉電流（INap）
　　實驗發(fā)現INaP電流幅值在三種興奮性類

9、型的神經元上有顯著差異，其在2型神經元上幅值最高((-394.5±58.97)pA,n=8)，在3型神經元上幅值最低((-27.5±27.5)pA,n=3)，在1型神經元上則介于兩者之間((-219.333±43.5367)pA,n=10)。
　　3.CCD模型三種興奮性分型的比例變化
　　在CCD模型DRG神經元三種興奮性分型的比例變化，發(fā)現神經病理性損傷后，三種類型的分布發(fā)生了顯著性改變，1型神經元明顯增多，3型神經元顯

10、著減少。說明CCD模型術后3型興奮性神經元向2型、1型興奮性神經元轉變。
　　4.CCD模型三種興奮性神經元INaP的變化
　　CCD組DRG不同類型神經元INaP的電流值與正常組比較發(fā)生了明顯變化，其中CCD組1型、2型興奮性神經元的INaP有不同程度的增高。
　　主要結論：
　　1、正常DRG神經元存在三種興奮性類型；INaP電流在正常三種興奮性神經元分布明顯不同。
　　2、在CCD組神經元興奮性分型的

11、比例發(fā)生了顯著改變；其中1與2型神經元的INaP有不同程度的增高。
　　3、DRG神經元損傷后分型比例的變化以及INaP的增高提示神經病理性損傷導致的最終電生理變化可能與INaP的變化密切相關，而這種結果提示我們調節(jié)INaP的變化可能成為影響神經病理性損傷后電變化的重要手段。
　　第二部分：Riluzole對INaP的抑制作用。
　　利魯唑（riluzole）在臨床上被用來治療神經紊亂性疾病，包括肌萎縮側索硬化癥（AL

12、S）[5]，或者作為一種神經保護劑，被用來治療脊髓[6]和腦部損傷[7]。Riluzole同時也被用于緩解神經病理性痛，但作用靶位不清楚。目前在臨床應用以及動物實驗中有爭論的結果要求我們對riluzole的細胞及分子機制加以研究。近來，一系列的報道提出持續(xù)鈉電流（INaP）在中樞神經元中主要參與神經元興奮性及節(jié)律的產生[8-11]，而riluzole可作為INaP通道相對特異的阻斷劑[12-18]。為了避免riluzole在中樞神經系統(tǒng)

13、的復雜性，我們將研究其在外周初級感覺傳入背根節(jié)上的細胞學效應。研究中應用了我室創(chuàng)建的背根節(jié)慢性壓迫模型，該模型在手術側可以誘發(fā)明顯的機械觸誘發(fā)痛行為[4]。本研究室發(fā)現riluzole可以抑制CCD模型DRG神經元的自發(fā)放電，發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用(見鄭大偉碩士畢業(yè)論文)，然而其在外周鎮(zhèn)痛作用的具體環(huán)節(jié)與機制卻不明了。為了判定持續(xù)流INaP在riluzole實現外周鎮(zhèn)痛效應中可能發(fā)揮的重要作用，本課題利用上述檢測INaP的膜片鉗技術進一步對r

14、iluzole作用的細胞電生理機制進行了分析，主要結果如下：
　　1.Riluzole通過抑制閾下膜電位振蕩(subthresholdmembranepotentialoscillation,SMPO)進而抑制受損DRG神經元的自發(fā)放電。
　　在CCD術后大鼠背根節(jié)離體標本上應用全細胞膜片鉗技術研究了28例大中型神經元。應用時長為800ms的去極化方波注入電流刺激，其中35％神經元（10/28）表現出SMPO及高頻放電。應用

15、10μMRiluzole后SMPO消失，重復放電減少并在用藥3min后消失。但該濃度并不影響其去極化誘發(fā)的首個動作電位。
　　2.Riluzole顯著抑制INaP
　　2μM的Riluzole對INaP就有很強的抑制作用。細胞被鉗制在-60mV后，應用3s的從-80到0mV的去極化斜波鉗制電位來測量INaP。內向鈉電流在-60～-50mV之間被激活，在-35mV左右達到峰值，并可被TTX阻斷。研究結果表明損傷A類DRG神經元

16、的INaP對riluzole的抑制有劑量依賴關系。
　　3.Riluzole對快電流（INaT）無明顯抑制作用
　　100μM的riluzole對INaT僅有較少影響。我們測量了riluzole對TTX敏感的瞬時鈉電流（INaT）的作用，發(fā)現riluzole只有在較高劑量時（500μM）才對INaT產生顯著減小的影響。
　　結論：
　　Riluzole可能通過抑制受損背根節(jié)神經元的INaP,進而抑制異位自發(fā)放電的