神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和骨骼肌對(duì)DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、骨骼肌(skeletalmuscle,SKM)同時(shí)接受運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)元的支配，肌梭是一種感受本體感覺的感受器。背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)是初級(jí)感覺神經(jīng)元的胞體聚集形成的，這些神經(jīng)元形成中樞部和外周部，在外周神經(jīng)末梢和脊髓之間建立感覺聯(lián)系。體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和肌細(xì)胞是目前研究神經(jīng)肌-接頭(neuromuscularjunction，NMJ)的形成、功能及其維持作用的重要手段之一，這種模式還用來研究神經(jīng)-肌功能

2、紊亂、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物篩選以及生物機(jī)器人的研發(fā)等。以往的研究認(rèn)為，感覺神經(jīng)元只是簡(jiǎn)單的跟隨運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元到達(dá)其相應(yīng)的靶組織，并且感覺神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)伴隨運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元且晚于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。但有研究證實(shí)，感覺神經(jīng)元有能力憑借自己的力量到達(dá)靶組織而不必借助運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的引導(dǎo)。這表明感覺神經(jīng)元在最初的軸突生長(zhǎng)的過程中對(duì)于靶組織的選擇或識(shí)別具有明顯的可塑性。
　　 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophics，NTs)是神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育和功能維持的重要

3、調(diào)節(jié)因子。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor,NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)是NTs家族中的成員，外源性給予這些營(yíng)養(yǎng)因子可以促進(jìn)已損傷的神經(jīng)元的修復(fù)和軸突的再生。神經(jīng)和肌之間NTs和一些分子的交換是神經(jīng)-肌連接進(jìn)行信息傳遞的物質(zhì)基礎(chǔ)。神經(jīng)元和靶組織之間各種因子的釋放和接受是兩者之間相互作用、相

4、互影響、相互依存的意義所在。NTs和靶組織SKM細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元功能和神經(jīng)-肌連接的維持具有重要作用。
　　 神經(jīng)元一旦識(shí)別到合適的靶組織，就會(huì)建立特定的神經(jīng)元和靶組織之間的聯(lián)系，這些聯(lián)系的建立包括突觸生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)以及功能性連接的形成。因此，本課題利用DRG與SKM細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，觀察DRG神經(jīng)元與靶組織SKM之間建立聯(lián)系即形成神經(jīng)-肌連接的過程，研究在各種實(shí)驗(yàn)條件下，靶組織SKM和NTs對(duì)DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用。

5、　　 第一部分靶組織骨骼肌對(duì)器官型培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)和遷移的影響
　　 神經(jīng)元和靶組織之間存在著相互依存的關(guān)系。在神經(jīng)元的發(fā)育過程中，神經(jīng)元延伸它的軸突到達(dá)相應(yīng)的靶組織，神經(jīng)元一旦與其支配的靶組織建立了聯(lián)系，便開始依靠靶組織的存活而存活，并由靶組織提供營(yíng)養(yǎng)支持。當(dāng)然，神經(jīng)元本身有其自身的生存、發(fā)育和代謝過程，但靶組織對(duì)神經(jīng)元的存活所起的作用是毋庸置疑的。有研究證實(shí)，在胚胎發(fā)育期，如果失去肢芽的營(yíng)養(yǎng)作用，感覺神經(jīng)元將出現(xiàn)支配

6、紊亂的現(xiàn)象，甚至失去存活的能力而走向程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeat，PCD)。外源性給予SKM提取物或肌球蛋白-2，可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活和感覺神經(jīng)元軸突的分支。有研究顯示，靶組織的炎癥可以抑制已損傷的神經(jīng)元的軸突再生。也有研究顯示，鞘細(xì)胞中的多種細(xì)胞成分可以產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)元的存活和軸突的生長(zhǎng)。
　　 生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（growth-associatedprotein-43，GAP-43）作為一種神經(jīng)元

7、特異性的鈣結(jié)合蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白在突觸前膜有高表達(dá)。GAP-43常被用來當(dāng)作突觸生長(zhǎng)發(fā)育和神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生的標(biāo)志物。感覺神經(jīng)肽在DRG神經(jīng)元表達(dá)水平的高低代表DRG神經(jīng)元的功能狀態(tài)變化，其中降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)是由降鈣素基因逆轉(zhuǎn)錄生成的一種神經(jīng)肽，它可在DRG神經(jīng)元表達(dá)，并發(fā)揮多種生物學(xué)功能，可參與多種感覺信息的調(diào)節(jié)，并且與肌的活力、血管舒張及炎癥反應(yīng)等功能的調(diào)

8、節(jié)有關(guān)。神經(jīng)絲（neurofilament,NF）是神經(jīng)元特異性中間絲，高分子量神經(jīng)絲（highmolecularmassneurofilament，NF-H）對(duì)正常神經(jīng)元的維持發(fā)揮重要作用，神經(jīng)絲蛋白-200(neurofilament-200，NF-200)屬于NF-H。隨著神經(jīng)元的成熟，NF-H的出現(xiàn)是決定軸突穩(wěn)定性的重要細(xì)胞內(nèi)事件。DRG神經(jīng)元可根據(jù)神經(jīng)生化免疫反應(yīng)分為神經(jīng)肽免疫反應(yīng)(neuropeptide-immunorea

9、ctive，NP-IR)和神經(jīng)絲免疫反應(yīng)(neurofilament-immunoreactive，NF-IR)神經(jīng)元兩種主要表型。NP-IR神經(jīng)元的突起構(gòu)成無髓鞘的和薄髓的痛覺傳入纖維，這種纖維主要分布于皮膚和內(nèi)臟，CGRP-IR神經(jīng)元可代表NP-IR神經(jīng)元;NF-IR神經(jīng)元的突起構(gòu)成有髓神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)纖維主要分布于肌梭，NF-200-IR神經(jīng)元可代表NF-IR神經(jīng)元。
　　 靶組織SKM對(duì)DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)和神經(jīng)元表型的變

10、化產(chǎn)生影響的作用及其機(jī)制目前仍不清楚。因此，本課題利用器官型DRG和分散SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，研究靶組織SKM對(duì)DRG神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)、神經(jīng)元的遷移、GAP-43、CGRP和NF-200的表達(dá)變化。
　　 本實(shí)驗(yàn)選取新生Wistar大鼠（出生后24h以內(nèi)），在無菌條件下取四肢的SKM，經(jīng)消化、離心、過濾后，制成單細(xì)胞懸液，種植于包被過多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，進(jìn)行SKM細(xì)胞的分散培養(yǎng)，培養(yǎng)3d至SKM細(xì)胞開始出現(xiàn)融合時(shí)，取孕15

11、d（embryonicday15，E15）Wistar胚胎大鼠的DRG，在體視顯微鏡下剝?nèi)ド窠?jīng)節(jié)外膜后，種植于多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)或種植于已種植了SKM細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)6d后，進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將培養(yǎng)的標(biāo)本共分為兩組:(1)DRG與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)組:器官型DRG組織塊與分散SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng);(2)DRG單純培養(yǎng)組:器官型DRG組織塊單獨(dú)培養(yǎng)。用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察不同培養(yǎng)條件下DRG神經(jīng)元與SKM

12、細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，終止培養(yǎng)后用掃描電子顯微鏡技術(shù)(scanningelectronmicroscopy,SEM)、免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)、Westernblot分析技術(shù)和realtime-PCR分析技術(shù)對(duì)不同培養(yǎng)條件下DRG神經(jīng)元進(jìn)行檢測(cè)，得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 (1)器官型DRG組織塊單獨(dú)培養(yǎng)或與分散SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)6d后，以DRG組織塊為中心，取右上1/4象限進(jìn)行神經(jīng)纖維束計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合培養(yǎng)環(huán)境下DRG神經(jīng)纖維束的數(shù)目明顯高于單

13、純培養(yǎng)環(huán)境中的DRG，并且聯(lián)合培養(yǎng)中的DRG的神經(jīng)纖維束可生長(zhǎng)到更遠(yuǎn)的距離。
　　 (2)器官型DRG組織塊單獨(dú)培養(yǎng)或與分散SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)6d，終止培養(yǎng)后經(jīng)SEM觀察，聯(lián)合培養(yǎng)環(huán)境下由DRG組織塊生長(zhǎng)出的神經(jīng)纖維束，與單純培養(yǎng)的DRG相比不僅數(shù)目明顯增加，而且神經(jīng)纖維束更加粗壯。聯(lián)合培養(yǎng)中由DRG組織塊遷出的神經(jīng)元數(shù)目，與單純培養(yǎng)的DRG相比明顯增多，而且遷移的距離較大，有的可達(dá)0.5mm以外。聯(lián)合培養(yǎng)中，由DRG組織塊生長(zhǎng)

14、出的神經(jīng)纖維可跨越多個(gè)肌管表面，在肌管表面形成密集的神經(jīng)纖維網(wǎng)，有的神經(jīng)纖維終末呈末端膨大終止于周圍的肌管表面。聯(lián)合培養(yǎng)中，由DRG組織塊遷出的單個(gè)神經(jīng)元分散于肌管之間，并發(fā)出突起越過或終止于肌管表面。
　　 (3)用微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associatedprotein2，MAP-2)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記由DRG組織塊遷出的神經(jīng)元，在熒光顯微鏡下定量計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合培養(yǎng)的DRG組織塊遷出的神經(jīng)元明顯多于單純培養(yǎng)

15、的DRG。
　　 (4)對(duì)遷出的神經(jīng)元進(jìn)行MAP-2和GAP-43、CGRP或NF-200免疫熒光雙標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合培養(yǎng)中DRG遷出的GAP-43-IR神經(jīng)元和NF-200-IR神經(jīng)元的比例明顯高于單純培養(yǎng)中的DRG，而CGRP-IR神經(jīng)元的比例則沒有變化。
　　 (5)經(jīng)Westernblot和realtime-PCR分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合培養(yǎng)的DRG內(nèi)GAP-43和NF-200及其mRNA的表達(dá)均顯著增加。
　　 以上

16、結(jié)果顯示，在器官型DRG和分散SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)中，由DRG組織塊生長(zhǎng)出的神經(jīng)纖維以及由DRG組織塊遷出的神經(jīng)元生長(zhǎng)出的神經(jīng)突起均可與肌管之間形成神經(jīng)-肌連接樣結(jié)構(gòu)。聯(lián)合培養(yǎng)中，靶組織SKM可促進(jìn)DRG神經(jīng)元的生長(zhǎng)與遷移，而且能促進(jìn)NF-IR神經(jīng)元表型的表達(dá)，而對(duì)NP-IR神經(jīng)元表型的影響作用不明顯。這表明聯(lián)合培養(yǎng)中，DRG神經(jīng)元和SKM之間不僅具有形態(tài)學(xué)上的神經(jīng)-肌連接的建立，而且靶組織SKM對(duì)DRG神經(jīng)元的促生長(zhǎng)作用及特定表型的影響

17、作用表明DRG神經(jīng)元與SKM之間具有功能性的相互作用關(guān)系。
　　 第二部分神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)DRG神經(jīng)元與骨骼肌聯(lián)合培養(yǎng)中生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響
　　 對(duì)NTs敏感的神經(jīng)元所支配的靶組織對(duì)神經(jīng)元的存活和分化有重要作用。有研究證實(shí)感覺保護(hù)可以通過調(diào)節(jié)SKM內(nèi)NTs的合成，從而提供一個(gè)良好的微環(huán)境。靶組織可以調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)元的功能和表型。在軸突再生的過程中，GAP-43選擇性的表達(dá)在發(fā)育中的神經(jīng)元的軸突。周圍神經(jīng)損傷后，GA

18、P-43在損傷的神經(jīng)和DRG內(nèi)都有表達(dá)。在培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元，NGF和BDNF等NTs可以影響GAP-43的表達(dá)，GAP-43對(duì)生長(zhǎng)錐的形成和軸突的生長(zhǎng)發(fā)揮重要的作用。具有靶組織聯(lián)系的DRG神經(jīng)元，與沒有靶組織聯(lián)系的DRG神經(jīng)元相比，其生長(zhǎng)過程中的可塑性變化可能是不同的。各種NTs是否對(duì)具有靶組織聯(lián)系的DRG神經(jīng)元GAP-43的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用目前仍不清楚。本課題利用分散的DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，研究NGF、BDNF和NT

19、-3對(duì)DRG神經(jīng)元GAP-43表達(dá)的影響作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用新生Wistar大鼠（出生后24h以內(nèi)）四肢的SKM，經(jīng)消化、離心、過濾后，制成單細(xì)胞懸液，種植在包被過多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，進(jìn)行SKM細(xì)胞的分散培養(yǎng)，培養(yǎng)3d，SKM細(xì)胞開始出現(xiàn)融合時(shí)，取E15Wistar大鼠胚胎的DRG，經(jīng)消化、離心和過濾后制成單細(xì)胞懸液，接種于含有SKM細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為4組:(1)NGF組:用NGF(終濃度為10ng/ml)孵

20、育6d;(2)BDNF組:用BDNF(終濃度為10ng/ml)孵育6d;(3)NT-3組:用NT-3（終濃度為10ng/ml）孵育6d;(4)對(duì)照組:不施加任何干擾因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)6d。終止培養(yǎng)后，用SEM、免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)、Westernblot分析技術(shù)和realtime-PCR分析技術(shù)等各種實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行檢測(cè)，得到以下結(jié)果。
　　 (1)SEM觀察顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)NGF、BDNF和NT-3孵育的聯(lián)合培養(yǎng)標(biāo)本，單個(gè)

21、DRG神經(jīng)元發(fā)出的突起數(shù)目較多，從1～5個(gè)不等，在單層分散的SKM細(xì)胞表面形成纖維網(wǎng)，有的突起在行程中有膨體樣結(jié)構(gòu)，有的突起末端變細(xì)，有的突起的末端會(huì)出現(xiàn)膨大樣改變，終止于SKM表面。
　　 (2)免疫熒光雙標(biāo)記、Westernblot和realtime-PCR分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)NGF、BDNF和NT-3孵育的聯(lián)合培養(yǎng)標(biāo)本，GAP-43-IR神經(jīng)元的比例、GAP-43蛋白水平及GAP-43mRNA水平顯著增加。

22、>　　 以上結(jié)果表明，外源性NGF、BDNF和NT-3可對(duì)分散的DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)中神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，這種作用可能與GAP-43的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。外源性NGF、BDNF和NT-3對(duì)DRG神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能與特定的NTs改善DRG神經(jīng)元再生的微環(huán)境有關(guān)。不同的NTs對(duì)不同亞群的DRG神經(jīng)元的特定影響作用尚有待于進(jìn)一步探討。
　　 第三部分NGF或NT-3對(duì)DRG神經(jīng)元與骨骼肌聯(lián)合培養(yǎng)中PP

23、T、CGRP、NF-200和MAP-2mRNA表達(dá)的影響
　　 特定的NTs除了促進(jìn)DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)以外，還可能會(huì)影響DRG神經(jīng)元多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成和蛋白的表達(dá)。P物質(zhì)(substanceP，SP)和CGRP均為在DRG神經(jīng)元表達(dá)的肽類神經(jīng)遞質(zhì)，與血管的舒縮活動(dòng)和感覺信息的傳遞有關(guān)。NF-200屬NF-H，對(duì)正常神經(jīng)元功能的維持有重要作用。MAP-2短暫性參與神經(jīng)元的生長(zhǎng)和細(xì)胞極性的形成，與微管、NF和肌動(dòng)蛋白相互作用，來維持神

24、經(jīng)元細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步檢測(cè)特定的NTs對(duì)DRG神經(jīng)元內(nèi)這些物質(zhì)表達(dá)的影響作用，本課題利用分散的DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，研究NGF和NT-3對(duì)DRG神經(jīng)元內(nèi)編碼SP的前速激肽原(preprotachykinin,PPT)mRNA、CGRPmRNA、NF-200mRNA和MAP-2mRNA表達(dá)的影響作用。
　　 實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的步驟與第二部分相同。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為3組:(1)NGF組:用NGF(終濃度為1

25、0ng/ml)孵育6d;(2)NT-3組:用NT-3（終濃度為10ng/ml）孵育6d;(3)對(duì)照組:不施加任何干擾因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)6d。終止培養(yǎng)后，用realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)PPT、CGRP、NF-200和MAP-2mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，NGF和NT-3均可促進(jìn)聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元PPT、CGRP和NF-200mRNA的表達(dá)，而對(duì)MAP-2mRNA的表達(dá)沒有明顯的影響作用。NGF和NT-3對(duì)聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元P

26、PT和CGRPmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用表明特定的NTs可促進(jìn)DRG神經(jīng)元肽類感覺神經(jīng)遞質(zhì)的發(fā)育或成熟;NGF和NT-3對(duì)聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元NF-200mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用表明特定的NTs與DRG感覺神經(jīng)元發(fā)育晚期的細(xì)胞內(nèi)事件有關(guān);NGF和NT-3對(duì)聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元MAP-2mRNA表達(dá)無顯著影響表明DRG神經(jīng)元本身或靶組織SKM細(xì)胞存在的影響足以觸發(fā)MAP-2mRNA的表達(dá)，而不依賴于外源性特定NTs的存在。NGF和NT-3對(duì)