RanBPM對(duì)BDNF促神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生和存活的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員，在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。BDNF受體可分為兩類：低親和力的p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75NTR)和高親和力的TrkB酪氨酸激酶受體。研究表明，BDNF對(duì)機(jī)體的生物學(xué)作用主要通過TrkB受體實(shí)現(xiàn)。BDNF與TrkB受體結(jié)合后，受體胞內(nèi)域的酪氨酸殘基被激活，繼而激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-a

2、ctivated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)信號(hào)通路和磷脂酶C-y(phospholipase C-Y，PLC-Y)信號(hào)通路等一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而介導(dǎo)BDNF的生物學(xué)功能。
　　 RanBPM(Ran-binding protein in the microtubule-organizing center，也

3、稱為RanBP9)廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)幾乎所有的組織中，尤其在心、腦和腎中有相對(duì)較高的表達(dá)量。RanBPM具有跟多種分子結(jié)合的特性，被認(rèn)為是一種支架分子。此外，RanBPM能夠與細(xì)胞表面受體MET，LFA-1，L1，Axl/Sky和Plexin-A等結(jié)合，參與不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。
　　 盡管RanBPM已經(jīng)被證實(shí)能夠與p75NTR和NGF受體TrkA結(jié)合，但是RanBPM在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子介導(dǎo)的生物學(xué)功能上的作用目前還不清楚。因

4、此，在該研究中，我們主要解決3個(gè)層次的問題：首先，RanBPM是否能夠與哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最豐富的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體TrkB結(jié)合？其次，如果二者能夠結(jié)合，RanBPM是否能夠參與BDNF介導(dǎo)的TrkB下游信號(hào)通路？最后，RanBPM是否能夠參與BDNF/TrkB介導(dǎo)的生物學(xué)功能，如神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生與存活？
　　 1.各種表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 2.大鼠RanBPM siRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及敲除效率的測(cè)定
　　

5、3.大鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色
　　 4.免疫共沉淀及Western blot
　　 5.PC12穩(wěn)定表達(dá)TrkB的細(xì)胞系（PC1210細(xì)胞系）的構(gòu)建
　　 6.BDNF介導(dǎo)的TrkB、TrkBY515磷酸化程度及信號(hào)分子MAPK、Akt活化程度檢測(cè)
　　 7.評(píng)估PC1210細(xì)胞分化與海馬神經(jīng)元樹突形態(tài)發(fā)生的檢測(cè)方法
　　 8.評(píng)估PC1210細(xì)胞凋亡的檢測(cè)手段
　　

6、 1、證實(shí)RanBPM是一種新發(fā)現(xiàn)的與TrkB結(jié)合的蛋白
　　 我們首先構(gòu)建了帶有HA標(biāo)簽的人類RanBPM cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-HA-hRan BPM）和帶有Flag標(biāo)簽的大鼠TrkB cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-Flag-rTrkB）。然后通過免疫共沉淀和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法，證實(shí)RanBPM和TrkB能夠相互結(jié)合，并且兩者在亞細(xì)胞水平有一致的定位。
　　 2、證實(shí)TrkB酪氨酸

7、激酶區(qū)與RanBPM結(jié)合
　　 我們首先構(gòu)建了缺失TrkB不同區(qū)域的突變體：△CT（缺失C末端）和△TK（缺失酪氨酸激酶區(qū)和C末端），通過免疫共沉淀的方法證明RanBPM與TrkB△CT結(jié)合，但不與TrkB△TK結(jié)合。隨后，我們構(gòu)建了突變體TrkB.T1（體內(nèi)存在的TrkB的一種截短的形式，胞內(nèi)區(qū)只含有近膜區(qū)的一點(diǎn)點(diǎn)）和T1TK（將酪氨酸激酶區(qū)嫁接到TrkB.T1上），并證實(shí)RanBPM不能與TrkB.T1結(jié)合，但能夠與T1TK

8、結(jié)合。
　　 3、證實(shí)TrkB的激酶活性對(duì)二者結(jié)合的重要性，NT4和BDNF都能夠促進(jìn)TrkB與RanBPM結(jié)合
　　 Trk抑制劑K252a能夠減弱RanBPM與TrkB的結(jié)合。RanBPM與喪失激酶活性的TrkB.KD的結(jié)合程度更弱。然而，TrkB的兩種配體NT4(30ng/ml)和BDNF(30 ng/ml)都能夠顯著增加TrkB/RanBPM的結(jié)合能力。
　　 4、RanBPM不影響B(tài)DNF介導(dǎo)的TrkB

9、和TrkBY515磷酸化，但參與調(diào)節(jié)BDNF介導(dǎo)的MAPK和PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　 研究證實(shí)：與相應(yīng)的對(duì)照組相比，過表達(dá)RanBPM和敲除RanBPM都不影響B(tài)DNF介導(dǎo)的TrkB和TrkBY515磷酸化。而與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的對(duì)照組相比，過表達(dá)RanBPM能夠促進(jìn)BDNF介導(dǎo)的信號(hào)分子MAPK和Akt的活化，并且這種作用是RanBPM劑量依賴的；敲除掉內(nèi)源性RanBPM之后，與對(duì)照siRNA相比，BDNF介導(dǎo)的MAP

10、K和Akt的活化程度都有所降低；此外，RanBPM參與調(diào)節(jié)MAPK短時(shí)程和長(zhǎng)時(shí)程兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式。
　　 5、RanBPM促進(jìn)BDNF介導(dǎo)的神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生
　　 與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的對(duì)照組相比，過表達(dá)RanBPM能夠促進(jìn)BDNF介導(dǎo)的PC1210細(xì)胞分化程度，包括分化比例的增加和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度的增加；此外，過表達(dá)RanBPM能夠增加BDNF介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元總的樹突數(shù)目和總的突起長(zhǎng)度。敲除掉內(nèi)源性RanBPM之

11、后，BDNF介導(dǎo)的PC1210細(xì)胞分化程度和海馬神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生程度都受到抑制。
　　 6、RanBPM增強(qiáng)BDNF在血清剝奪引起的細(xì)胞凋亡方面的保護(hù)作用
　　 在加入BDNF情況下，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的對(duì)照組相比，過表達(dá)RanBPM組中血清剝奪引起的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少；而敲除內(nèi)源性RanBPM后，細(xì)胞凋亡數(shù)目較對(duì)照siRNA組明顯增加，這說明RanBPM能夠參與BDNF在血清剝奪引起的細(xì)胞凋亡方面的保護(hù)作用。