胚胎神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)于死后人腦老化神經(jīng)元的促存活作用研究.pdf

1、由于干細(xì)胞具有自我增殖，分化和修復(fù)的特性，外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，雖然在帕金森氏病的治療方面顯示出一定的臨床應(yīng)用前景。但是細(xì)胞移植的定點(diǎn)性決定了其治療的區(qū)域性的特點(diǎn)，對(duì)于病變累及廣泛的神經(jīng)退行性疾病，比如阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)并不是一個(gè)完美的治療方案。理想的方案應(yīng)當(dāng)是神經(jīng)干細(xì)胞所釋放的物質(zhì)可廣泛的作用于AD不同區(qū)域的腦組織。在AD的病理改變中給我們留的一個(gè)機(jī)會(huì)是：A

2、D腦內(nèi)大量神經(jīng)元并沒(méi)有死亡而是“失活”，適當(dāng)?shù)拇碳た墒故Щ畹纳窠?jīng)元再激活。我們的假設(shè)是： AD腦組織中廣泛受累“失活”的神經(jīng)元或者“沉默”的神經(jīng)元可被外源性神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的因子修復(fù)或再激活，從而恢復(fù)神經(jīng)元的部分功能。 為驗(yàn)證該假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)將死后人腦組織運(yùn)動(dòng)皮層腦組織切片(AD組，n=7；老年非癡呆對(duì)照組， n=6)與大鼠胚胎來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞體外“分離式”共培養(yǎng)，對(duì)AD腦組織進(jìn)行細(xì)胞活性檢查(live/dead kit)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

3、： 1.體外培養(yǎng)的死后腦組織仍具有活性。 Live/dead kit染色顯示培養(yǎng)的AD腦組織存在活細(xì)胞(綠色胞漿，空細(xì)胞核)，死細(xì)胞(紅色細(xì)胞核)，中間態(tài)細(xì)胞(綠色胞漿，紅色細(xì)胞核)。在體外組織培養(yǎng)(0-30天)的過(guò)程中，三種細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著性改變，p值分別為0.91，0.09，0.78。 2.在正常培養(yǎng)的條件下AD腦片包含更少的活的神經(jīng)元。 AD來(lái)源的腦片的存活神經(jīng)元數(shù)目少于正常對(duì)

4、照組(P=0.017)，并且顯示出較老年對(duì)照明顯的個(gè)體差異。 3.干細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)死后腦組織的存活狀態(tài)。 與未處理組或成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組(作為干細(xì)胞的對(duì)照)相比，神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)組的腦片有更多的存活細(xì)胞(約增加2600個(gè)/mm<'2>，p<0.001)和更少的死細(xì)胞(約減少9500個(gè)/mm<'2>，p<0.001)。而共培養(yǎng)沒(méi)有明顯增加兩組腦片中間態(tài)的細(xì)胞數(shù)目(p=0.36)。 上述結(jié)果證明了共培養(yǎng)具有神經(jīng)保護(hù)

5、和促進(jìn)損傷修復(fù)的作用，接下來(lái)的問(wèn)題是：存活的細(xì)胞是否具有轉(zhuǎn)錄活性?本研究進(jìn)一步探討了神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)人腦組織轉(zhuǎn)錄水平的影響，運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢測(cè)了在共培養(yǎng)期間常規(guī)參考基因及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，應(yīng)激相關(guān)基因JIP-1的mRNA水平的改變。 1.沒(méi)有表達(dá)恒定的“參考基因”。 在死后腦組織培養(yǎng)體系中，沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)水平恒定的“參考基因”(GAPGH EF1α，β-actin，YWHAZ，UBC)，但是上述基

6、因表達(dá)顯示出很高的相關(guān)性。 2.神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)老化神經(jīng)元產(chǎn)生更多的NSE mRNA。 NSE是神經(jīng)元特異性表達(dá)的基因，參與神經(jīng)元的糖酵解過(guò)程。在老年對(duì)照組，神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)組的腦片顯示出較高NSE的轉(zhuǎn)錄水平，采用在內(nèi)部平衡的2-ACT’[△Ct'=Ct(DIV10)-Ct(未處理DIV3)]法分析PCR結(jié)果顯示P<0.001(ANOVA)或者p=0.021(Mann-Whitney)，提示共培養(yǎng)處理組神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄水平顯著

7、高于未處理組。同細(xì)胞活性染色一致，AD組的NSE mRNA水平亦較對(duì)照組為低。 3.體外培養(yǎng)的AD腦片未檢測(cè)到應(yīng)激敏感蛋白JIP-1的表達(dá)。 JIP-1是參與JNK和AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的應(yīng)激敏感型蛋白，最新研究發(fā)現(xiàn)與磷酸化的β淀粉樣蛋白前體的運(yùn)輸有關(guān)。在凍存老年和AD腦組織均檢測(cè)到穩(wěn)定的JIP-1mRNA表達(dá)，但是培養(yǎng)的AD腦片中未檢測(cè)到其mRNA存在提示AD神經(jīng)元對(duì)外界的反應(yīng)較對(duì)照組低下。 4.慢病毒載體轉(zhuǎn)染的