柱前手性衍生化高效液相法測定人血漿和尿液中的D-谷氨酸和D-絲氨酸.pdf

1、目的：人們很早已經(jīng)認識到哺乳動物體內(nèi)氨基酸的存在形式主要是L-型氨基酸，L-型氨基酸構(gòu)成各種活性蛋白質(zhì)分子和酶，發(fā)揮生理作用。但是近些年來隨著分析技術(shù)的進步，人們對哺乳動物體內(nèi) D-型氨基酸的發(fā)現(xiàn)和研究日益增多，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn) D-絲氨酸、D-天門冬氨酸和D-蘇氨酸等，并且在此基礎上對D-氨基酸可能參與的生理、病理過程進行了系列研究。研究發(fā)現(xiàn)，人腦內(nèi)D-絲氨酸的濃度與Alzheimer’s disease(阿爾茨海默病)，Parkinsi

2、ological disease(帕金森)，Schizophrenia (精神分裂癥)and renal diseases ect. (腎病)等疾病的發(fā)生和發(fā)展存在著直接或間接的關聯(lián)。因此，進一步研究其他D-氨基酸是否(如D-谷氨酸)在人體內(nèi)與人體的成長衰老之間存在某些相關性，這一切都使本文所做的研究具有重要的意義。 谷氨酸主要存在于腦中樞，是人體內(nèi)一種興奮性遞質(zhì)，參與興奮的傳遞，介導學習、思考、記憶、認知和推理等智力活動的過程

3、。在體內(nèi)，谷氨酸構(gòu)成的谷胱甘肽通過γ-谷胺酰循環(huán)參與其他多種氨基酸的轉(zhuǎn)運和吸收。谷氨酸是體內(nèi)聯(lián)合轉(zhuǎn)氨作用最重要的中介氨基酸?？梢哉f，谷氨酸是人體內(nèi)所有生理活動中最活躍的氨基酸之一，其產(chǎn)生和作用的機制受到體內(nèi)激素(甾體激素類)的調(diào)節(jié)，并且與其他氨基酸的共同保持和維持多種體內(nèi)平衡。絲氨酸是在中樞神經(jīng)信息傳遞到達受體進而產(chǎn)生效應過程中一種內(nèi)源性遞質(zhì)。D-氨基酸作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)N-甲基-D-天門冬氨酸受體，后者在人正常生理和病理生理過程中具

4、有極其重要作用，如接受能力和精神分裂癥，腎病，腦缺血等。 現(xiàn)有氨基酸的分析測定的報道多數(shù)為應用液相色譜(LC)，毛細管電泳或者氨基酸分析儀手性分離檢測生物體的 DL-谷氨酸和 DL-絲氨酸含量。尚未見D-谷氨酸與人年齡相關性的研究報導。本文通過建立了手性分離血漿和尿液中D-谷氨酸和D-絲氨酸的方法，對不同人群體內(nèi)D-谷氨酸和D-絲氨酸進行了初步研究。 方法： 本文應用柱前手性衍生化反相高效液相色譜法，鄰苯二甲醛(

5、OPA)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)為柱前手性衍生化試劑，檢測器為熒光檢測器(FLD)，使用梯度洗脫程序，建立了手性分離包括DL-Glu和DL-Ser在內(nèi)19對氨基酸異構(gòu)體的方法，通過此方法，D-Glu和D-Ser異構(gòu)體可以完全分離，而不受其它氨基酸異構(gòu)體的干擾；然后在此基礎上建立手性分離血漿和尿液中D-Glu、D-Ser的方法，并應用此方法測定不同年齡段，不同性別的正常人血漿和尿樣中的 D-谷氨酸和D-絲氨酸。 色譜柱：

6、大連依利特Htypersil C<,18>(4.6×150mm i.d.5μm，大連依利特分析儀器有限公司)；本研究使用流動相包括兩種，流動相Ⅰ：色譜純甲醇(A組分)；流動相Ⅱ：50mmol/L NH4 Ac緩沖液(pH 6.0)(B組分)，梯度洗脫步驟：0-13min A組分為7％ B組分93％；13-40min A組分由7％降為4％ B組分升為96％；40-50min A組分為13％B組分87％；50-70min A組分90％B組分

7、10％。 紫外檢測波長：345nm 熒光檢測波長：λ激發(fā)波長350nm，λ發(fā)射波長450nm 流速：1.0ml·min<'-1> 柱溫：室溫 進樣量：20μL 結(jié)果： 以鄰苯二甲醛(OPA)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)為柱前手性衍生化試劑，柱前手性衍生化反相高效液相色譜法成功手性分離了包括DL-谷氨酸和DL-絲氨酸在內(nèi)的19對氨基酸對映異構(gòu)體；在此基礎上建立手性分離血漿和尿液

8、中 D-谷氨酸和D-絲氨酸的方法；測定了不同性別和年齡的正常人體內(nèi)D-谷氨酸和D-絲氨酸的含量。通過研究發(fā)現(xiàn)正常人體內(nèi)D-谷氨酸的含量和年齡呈正相關。結(jié)果顯示，在血漿和尿液中方法的相對標準偏差不大于6％，在較寬的范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)在0.9990。D-谷氨酸的最低檢測限為0.5ng,D-絲氨酸的最低檢測限為 0.6ng。實驗證明本方法用于檢測血漿樣品中D-谷氨酸和D-絲氨酸具有專屬性強、操作簡便快速、分離效果好、

9、準確度高的特點。 結(jié)論： 建立以鄰苯二甲醛(OPA)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)為手性衍生化試劑，柱前手性衍生化反相高效液相色譜法，手性分離了包括DL-谷氨酸和DL-絲氨酸在內(nèi)的19種氨基酸對映異構(gòu)體；在此條件下DL-谷氨酸和DL-絲氨酸可達基線分離，而且手性分離D-谷氨酸和D-絲氨酸不受其他氨基酸對映異構(gòu)體的干擾。通過文中建立的方法手性分離血漿和尿液中 D-Glu和D-Ser，檢測了正常人血漿中D-谷氨酸和D-絲