攜帶GFP綠色熒光標(biāo)記的重組BAC-HSV-1HF株的構(gòu)建及其子代病毒的特性研究.pdf

1、單純皰疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1)是一種重要的人類致病原，可導(dǎo)致從輕度的皮膚感染到致命性腦炎等不同程度的多種疾病。HSV-1基因組是一個(gè)包含有152 kbp堿基的雙鏈線性DNA，其基因組包括至少75種蛋白編碼基因。盡管目前HSV-1的大部分結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)研究清楚，然而仍有很多病毒基因的功能未被闡明，同時(shí)其順式作用元件如何調(diào)控基因的表達(dá)以及基因與基因之間的相互作用也不十分清楚，問(wèn)題的困難性最

2、終體現(xiàn)在HSV-1龐大而復(fù)雜的基因組上。其龐大而復(fù)雜的基因組使其在真核細(xì)胞內(nèi)的基因操作如定點(diǎn)基因的突變及某些基因的靶向敲除變的十分困難，從而不利于HSV-1各基因功能的研究。近幾年來(lái)發(fā)展的以細(xì)菌人工染色體為基礎(chǔ)的可攜帶大片段外源DNA的全新技術(shù)可使HSV-1全基因組以BAC(Bacterial artificial chromosome)質(zhì)粒的形式在大腸桿菌中進(jìn)行保存、增殖和遺傳修飾。與在真核細(xì)胞中進(jìn)行的操作相比，HSV-1全基因組以質(zhì)

3、粒的形式在大腸桿菌中進(jìn)行的操作具有簡(jiǎn)單快速、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。BAC-HSV-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后可重建具有感染性的HSV-1子代病毒，從而可促進(jìn)HSV-1整個(gè)基因組中不同基因功能的研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌的F因子即BAC，在真核細(xì)胞內(nèi)利用同源重組的方法成功構(gòu)建了含HSV-1全基因組的BAC-HSV-1，其重組部位為HSV-1的復(fù)制非必須基因，且BAC的兩端含有同向的loxP位點(diǎn)，經(jīng)Cre酶作用后，可以產(chǎn)生不含BAC的子代

4、重組病毒，使得對(duì)單純皰疹病毒的各基因功能分析及遺傳分析提升到了一個(gè)新的階段，為進(jìn)一步研究該病毒株的性質(zhì)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.構(gòu)建由BAC攜帶的HSV-1質(zhì)粒及攜帶綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)的重組型BAC-HSV-1HF株感染性子代病毒；
　　 2.探討B(tài)AC-HSV-1HF株重組病毒的復(fù)制增殖能力；
　　 3.探討B(tài)AC-HSV-1HF株

5、重組病毒BAC元件的操作性。
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建BAC-HSV-1重組質(zhì)粒
　　 (1)構(gòu)建攜帶HSV-1同源臂的質(zhì)粒C223-左右同源臂質(zhì)粒以HSV-1 UL43-47的側(cè)翼序列為模板設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增同源重組用HSV-1左右同源臂，將左右同源臂定向克隆至C223質(zhì)粒的SacⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒C223-左右同源臂DNA。
　　 (2)C223-左右同源臂與HSV-1同源重組MluⅠ酶切C2

6、23-左右同源臂，使其線性化，脂質(zhì)體包埋法將線性化的C223-左右同源臂DNA片段轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，24小時(shí)后，用MOI=0.01的HSV-1病毒感染Vero細(xì)胞，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)真核細(xì)胞內(nèi)同源重組產(chǎn)生含GFP報(bào)告基因的BAC-HSV-1重組病毒。
　　 (3)噬斑純化篩選攜帶綠色熒光報(bào)告基因的BAC-HSV-1重組病毒，Hirt法提取BAC-HSV-1環(huán)形DNA，電轉(zhuǎn)化重組病毒環(huán)形DNA至DH10B感受

7、態(tài)菌中，挑取BAC-HSV-1重組質(zhì)?？寺?，經(jīng)PCR和酶切法鑒定BAC-HSV-1重組質(zhì)粒。
　　 2.質(zhì)粒型BAC-HSV-1子代病毒的重建與特性研究
　　 (1)重組病毒BAC-HSV-1重建與特性研究將實(shí)驗(yàn)組BAC-HSV-1和對(duì)照組HSV-1基因組DNA以脂質(zhì)體包埋法各轉(zhuǎn)染2ugDNA至Vero細(xì)胞，48小時(shí)后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況和綠色熒光蛋白表達(dá)情況。72小時(shí)后收取細(xì)胞上清液，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(

8、50％tissue culture infective dose，TCID50)法測(cè)定兩組病毒滴度，將收獲的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的子代病毒以MOI=0.01再次感染Vero細(xì)胞，TCID50法測(cè)定兩組病毒滴度。兩組將病毒滴度采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS16.0軟件分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)重組病毒BAC-HSV-1中BAC的可操作性研究實(shí)驗(yàn)組A組Vero細(xì)胞給予MO

9、I=2的重組復(fù)制缺陷型腺病毒Adv-Cre，18h后，以MOI=0.01的BAC-HSV-1重組病毒感染Vero細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組B組Vero細(xì)胞給予MOI=2的重組復(fù)制缺陷型腺病毒Adv，18h后，以MOI=0.01的BAC-HSV-1病毒感染Vero細(xì)胞。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待各組細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE后收集病變細(xì)胞上清液，將收集的病變細(xì)胞上清液于-80℃和37℃之間凍融3次，3000rpm/min離心10分鐘，各取10ul上清液分別感染Ver

10、o細(xì)胞，24h后，熒光3000rpm/min離心10分鐘，各取10ul上清液分別感染Vero細(xì)胞，24h后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了HSV-1 HF病毒株的BAC-HSV-1質(zhì)粒-病毒穿梭系統(tǒng)；
　　 2.BAC-HSV-1重組病毒在Vero細(xì)胞的復(fù)制增殖能力與原HSV-1病毒相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.079)：
　　 3.成功重建不含BAC元件的BAC-H