氨氯地平和依普利酮聯(lián)合應(yīng)用在緩解鹽敏感高血壓所致腎臟損害中作用機制的研究.pdf

1、研究背景和目的： 世界范圍內(nèi)大約10億人正在受到高血壓的困擾。臨床研究表明：大約50％的高血壓患者為鹽敏感高血壓。而鹽敏感高血壓正是導(dǎo)致心血管疾病以及腎臟功能損害的最為重要的致病因素之一。有研究表明：腎功能不全的發(fā)生與腎間質(zhì)纖維化具有極為密切的關(guān)系。一些研究發(fā)現(xiàn)：慢性腎間質(zhì)缺氧在腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮了重要作用并最終導(dǎo)致腎功能不全的發(fā)生。此外，一些導(dǎo)致慢性腎間質(zhì)缺氧的誘因也已經(jīng)查明，其中最為重要的是腎小管周毛細(xì)血管損傷以及血流減少。

2、 缺氧導(dǎo)致的ATP耗竭，會導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高以及線粒體的損傷并進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。L型鈣通道阻斷劑可以顯著降低由缺氧所導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。此外，有人發(fā)現(xiàn)L型鈣通道阻斷劑還可以顯著降低由腎臟缺血再灌注所導(dǎo)致的腎臟各類細(xì)胞凋亡以及由血管緊張素Ⅱ所導(dǎo)致的腎小管周闈缺血。以上研究暗示，一些臨床研究中L型鈣通道阻斷劑的腎臟保護作用可能是通過對腎間質(zhì)缺氧的抑制而實現(xiàn)的。然而氨氯地平在高血壓中腎臟保護作用的機制尚需進一步研

3、究。 傳統(tǒng)認(rèn)為，醛固酮通過作用于遠(yuǎn)端腎單位來調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡以及血壓的穩(wěn)定。但是最近人們對醛固酮的認(rèn)識發(fā)生了變化。越來越多的證據(jù)表明，醛固酮在心血管以及腎臟損害過程中發(fā)揮了重要的作用。在腎臟損害方面，許多研究證明：醛固酮水平的升高可以導(dǎo)致蛋白尿、腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化。亦有研究發(fā)現(xiàn)，在醛固酮持續(xù)灌注SD大鼠中，腎小球表達(dá)的正常足細(xì)胞標(biāo)記物podocin和nephrin顯著降低，然而損傷足細(xì)胞標(biāo)記物desmin表達(dá)卻顯著升高

4、。鹽皮質(zhì)激素受體(MR)阻斷劑依普利酮可以顯著改善由醛固酮水平升高導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷以及蛋白尿。因此，足細(xì)胞損傷的治療將具有重要臨床意義。以上研究提示，MR在足細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮了重要作用，其可能機制尚需進一步研究。并且，聯(lián)合應(yīng)用氨氯地平和依普利酮是否能夠提供更好的腎臟保護作用尚需研究。 本研究首次研究了氨氯地平和依普利酮聯(lián)合應(yīng)用對于高鹽誘導(dǎo)的Dahl salt—sensitve(DS)大鼠鹽敏感血壓以及腎臟損害的治療作用。并對其

5、可能機制進行了深入探討。 方法： 高鹽飼料誘導(dǎo)的鹽敏感高血壓合并腎臟損害動物模型的建立 6周齡Dahl salt—sensitve(DS)大鼠飼以0.4％低鹽飼料或4％高鹽飼料，每兩周行血壓測定以及24小時尿蛋白測定。至第16周齡時，相對于低鹽飼料喂養(yǎng)DS大鼠，高鹽飼料喂養(yǎng)DS大鼠的收縮壓(SBP)超過170 mmHg并且尿蛋白超過70 mg/24h。組織學(xué)檢查可見嚴(yán)重腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化。以上結(jié)果證實：高

6、鹽飼料誘導(dǎo)的赫敏感高血壓合并腎臟損害動物模型建立成功。 實驗動物分組：6周齡DS大鼠40只隨機分為兩組：對照組(8只，LS)喂以0.4％低鹽飼料(Oriental Yeast，大阪，日本)，實驗組(32只，HS)喂以4％高鹽飼料(Oriental Yeast，大阪，日本)。8周齡時將實驗組大鼠進一步隨機分為4組：陽性對照組(8只，HS)，氨氯地平治療組(8只，3 mg/kg/day，HS+A)，依普利酮治療組(8只，50 mg/

7、kg/day，HS+E)和聯(lián)合用藥組(8只，HS+A+E)，治療時間均為8周。整個實驗過程共計10周。 實驗期間，每兩周采用套尾法測量血壓以及代酣籠采集24小時尿液各一次。血漿和腎臟標(biāo)本在苯巴比妥麻醉狀態(tài)下采集，其中腎臟首先行生理鹽水灌注沖洗，然后切片放入10％福爾馬林(pH7.4)固定石蠟包埋用于組織學(xué)檢查，或者直接放入OCT冰凍切片包埋劑制作冰凍切片用于激光捕獲微分離(LCM)。剩余腎臟組織放入液氮冷凍并且放入—80℃深低溫

8、冰箱保存。 1.尿液及血液生化學(xué)檢查 通過24小時尿蛋白和尿肌酐測定以及血肌酐測定，了解腎臟功能損害情況。通過對血漿鈉離子、鉀離子和醛固酮水平測定了解體內(nèi)電解質(zhì)代謝狀況。 2.組織學(xué)檢查 通過PAS染色對腎小球硬化的程度進行評估。通過Azan染色對腎間質(zhì)纖維化進行評估。 3.免疫組織化學(xué)檢查 通過對缺氧標(biāo)記物pimonidazole免疫組織化學(xué)染色對腎間質(zhì)缺氧進行檢測，aminopepti

9、dase P免疫組織化學(xué)染色來評價腎間質(zhì)毛細(xì)血管密度，desmin的免疫組化染色來檢測足細(xì)胞損傷。 4.腎小球的激光捕獲微分離和總RNA提取 通過激光捕獲微分離技術(shù)分離腎小球組織并提取總RNA。 5.Real-Time PCR 通過方法4中提取的總RNA合成cDNA文庫。并通過Real-Time PCR檢測腎小球podocin、nephrin、MR和Sgk—1表達(dá)。 6.統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)

10、據(jù)均以x±SE表示。各組間統(tǒng)計學(xué)比較通過方差分析(ANOVA)以及多重比較的Bonferroni事后檢驗進行。 結(jié)果： 1.成功建立鹽敏感高血壓合并腎臟損害動物模型。 2.收縮壓(SBP) 高鹽飼料喂養(yǎng)的DS大鼠產(chǎn)生了嚴(yán)重的高血壓。并且各個治療組降低血壓的水平相近。 3.24h尿蛋白，24h尿蛋白/尿肌酐比值(Urinary protein/creatinine ratio，UPCR)，血漿肌酐(

11、Plasma creatinine)以及內(nèi)生肌酐清除率(Creatinine clearance，Ccr) 高鹽飼料喂養(yǎng)DS大鼠發(fā)生了24h尿蛋白和UPCR的顯著增加，單一用藥可以顯著降低24h尿蛋白和UPCR水平。但是，聯(lián)合用藥組可以更好的降低24h尿蛋白和UPCR水平。高鹽飼料喂養(yǎng)DS大鼠同樣也導(dǎo)致了血肌酐的增加以及內(nèi)生肌酐清除率的降低。只有聯(lián)合用藥組可以顯著抑制血肌酐的增加以及內(nèi)生肌酐清除率的降低。 4.組織學(xué)檢查

12、 低鹽飼料飼養(yǎng)DS大鼠的腎小球以及腎間質(zhì)完全正常。高鹽飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致了DS大鼠嚴(yán)重的腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化。單一應(yīng)用依普利酮可以顯著降低腎小球硬化。然而，與依普利酮比較而言，單一應(yīng)用氨氯地平可以很好的減輕腎間質(zhì)纖維化。聯(lián)合用藥組對腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化均具有很好的治療效果。 5.MR激活導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷 高鹽飼料喂養(yǎng)DS大鼠腎小球podocin和nephrin表達(dá)顯著降低，然而desmin表達(dá)卻顯著升高。該

13、結(jié)果提示著足細(xì)胞損傷的存在。單一應(yīng)用依普利酮或者聯(lián)合用藥可以顯著改善足細(xì)胞損傷。通過進一步檢測MR表達(dá)以及MR活性標(biāo)志物Sgk—1我們發(fā)現(xiàn)，高鹽飼料喂養(yǎng)DS大鼠可以促進MR表達(dá)水平升高。盡管依普利酮不能夠降低MR的表達(dá)水平。但是，單一應(yīng)用依普利酮或者聯(lián)合用藥可以顯著降低Sgk—1的表達(dá)。 6.腎間質(zhì)缺氧檢測 高鹽飼料導(dǎo)致了腎間質(zhì)pimonidazole陽性區(qū)域顯著增加。這一結(jié)果提示腎間質(zhì)缺氧的存在。氨氯地平可以部分改善腎

14、間質(zhì)缺氧的情況，但是依普利酮卻沒有任何效果。而聯(lián)合用藥可以顯著改善腎間質(zhì)缺氧的情況。已有研究表明，腎間質(zhì)缺氧與腎間質(zhì)毛細(xì)血管的缺失有重要關(guān)系。本實驗發(fā)現(xiàn)，高鹽飼料喂養(yǎng)DS大鼠同樣導(dǎo)致了腎間質(zhì)毛細(xì)血管的缺失。氨氯地平或聯(lián)合用藥可以顯著改善腎間質(zhì)毛細(xì)血管的缺失，而依普利酮卻沒有任何效果。 結(jié)論： 1.腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化并不一定同時發(fā)生。二者均與腎功能密切相關(guān)，任何一種損傷均可以造成24小時尿蛋白水平升高。 2