人參總皂苷和小檗堿對(duì)腫瘤主動(dòng)性免疫逃逸機(jī)制的影響.pdf

1、免疫逃逸在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用，其機(jī)制復(fù)雜，涉及腫瘤和宿主兩方面。從腫瘤角度來說，一方面，腫瘤抗原的缺失、MHC分子的改變、共刺激分子的缺乏等可以使腫瘤免受宿主免疫細(xì)胞的識(shí)別，從而逃脫抗腫瘤免疫反應(yīng)；另一方面，腫瘤也可以通過"Fas反擊機(jī)制"、免疫抑制性分子的分泌等機(jī)制主動(dòng)影響抗腫瘤免疫細(xì)胞的增殖活化或功能。人參總皂苷(Gs)、小檗堿(Ber)分別是補(bǔ)益藥人參和清熱解毒藥黃連等的組分，抗腫瘤作用明顯。Gs和Ber的抗腫瘤

2、作用機(jī)制主要是抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡，抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)分化等方面，在腫瘤免疫逃逸機(jī)制方面的研究尚未見報(bào)道。本研究觀察了Gs和Ber對(duì)人肺癌PG細(xì)胞抑制Jurkat T淋巴細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的影響，以及對(duì)PG細(xì)胞FasL、Fas分子的表達(dá)及其TGF-β1、PGE2分泌的作用，以探討Gs和Ber對(duì)腫瘤細(xì)胞主動(dòng)性免疫逃逸機(jī)制的影響，為Gs和Ber的抗腫瘤作用機(jī)制擴(kuò)展新的研究內(nèi)容，并為藥物的合理運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究運(yùn)用人參總皂苷

3、和小檗堿處理肺癌PG細(xì)胞24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組如下：Control組(PG細(xì)胞未經(jīng)藥物處理)，Gs組(PG細(xì)胞經(jīng)100μg/ml人參總皂苷處理)和Ber組(PG細(xì)胞經(jīng)10μg/ml小檗堿處理)。 1.首先建立PG細(xì)胞與JurkatT細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，觀察JurkatT細(xì)胞的生長狀況和增殖情況。 (1)倒置顯微鏡下直接觀察到，Jurkat T細(xì)胞在單獨(dú)培養(yǎng)情況下成團(tuán)生長，而Jurkat T細(xì)胞與PG細(xì)胞共培養(yǎng)24h后呈散在

4、生長；Jurkat T細(xì)胞與Gs組和Ber組PG細(xì)胞共培養(yǎng)后數(shù)目均較Control組明顯減少。 (2)臺(tái)盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)6h、24h后，Jurkat T細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與單獨(dú)培養(yǎng)組(Jurkat T組)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而Jurkat T細(xì)胞與Gs組PG細(xì)胞共培養(yǎng)6h、24h后其生長抑制均較Control組明顯，Jurkat T細(xì)胞與Ber組PG細(xì)胞共培養(yǎng)24h后其生長抑制也與Control組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

5、 (3)PG細(xì)胞培養(yǎng)上清液與Jurkat T細(xì)胞孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組PG細(xì)胞培養(yǎng)上清液與T細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)不變)的體積比為2：1、1.1、0.5：1時(shí)，Jurkat T細(xì)胞的生長均受到抑制，大部分組與陰性對(duì)照組(Jurkat T組)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且呈體積依賴性；各不同體積比組中，Gs組、Ber組與Control組比較均無差異。結(jié)果提示，PG細(xì)胞對(duì)Jurkat T細(xì)胞的生長有抑制作用，此作用在人參總皂苷和小檗堿處理PG細(xì)胞后更為顯

6、著。 2.分別用形態(tài)學(xué)方法和流式細(xì)胞術(shù)觀察和檢測了共培養(yǎng)體系中Jurkat T細(xì)胞的凋亡。 (1)Giemsa染色結(jié)果顯示，單獨(dú)培養(yǎng)的Jurkat T細(xì)胞形態(tài)均一，呈球形，核大，幾乎占據(jù)整個(gè)胞漿，呈均勻的紫黑色；共培養(yǎng)組JUrkatT細(xì)胞形態(tài)不均一，不規(guī)則細(xì)胞增多，核可見裂紋及固縮現(xiàn)象； (2)在熒光顯微鏡下，吖啶橙染色顯示：單獨(dú)培養(yǎng)組Jurkat T細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光，圓形，形態(tài)均一，胞漿呈橘紅

7、色或熒光不明顯；共培養(yǎng)組Jurkat T細(xì)胞形態(tài)不均一，可見細(xì)胞核綠色熒光呈半月型等固縮形態(tài)，并可見呈現(xiàn)弱熒光的細(xì)胞。 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，Jurkat T細(xì)胞在單獨(dú)培養(yǎng)條件下的自然凋亡率較低(早期凋亡率為：5.57％，中晚凋亡率為：4.67％)，而各共培養(yǎng)組均表現(xiàn)出較高的凋亡率(早期凋亡率>10％，而中晚期凋亡率為50％左右)，兩者不管在早期或中晚期差異均有極顯著性；而共培養(yǎng)Gs組的Jurkat T細(xì)胞早期凋亡率為1

8、5.79％，與Control組比較(11.40％)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Bet組凋亡率與對(duì)照組無差異；而Gs組、Ber組Jurkat T細(xì)胞的中晚期凋亡率與Control組比較差異不明顯，但Gs組與Ber組的總凋亡率，即各期凋亡率總和，與Control組比較均有差異。結(jié)果提示，PG細(xì)胞可以誘導(dǎo)JurkatT細(xì)胞的凋亡，Gs和Ber均可以促進(jìn)PG細(xì)胞誘導(dǎo)JurkatT細(xì)胞的凋亡。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測PG細(xì)胞FasL、Fas分子的表達(dá)。

9、 (1)肺癌PG細(xì)胞有FasL，分子的表達(dá)，主要分布在胞漿；Gs和Ber均可使PG細(xì)胞FasL分子的陽性表達(dá)增強(qiáng)。 (2)Fas分子在PG細(xì)胞也有表達(dá)，主要分布在胞漿，胞膜亦有表達(dá)；Gs和Ber對(duì)Fas分子表達(dá)無明顯影響。 (3)FasL、Fas分子表達(dá)的圖像分析結(jié)果表明，Gs和Ber對(duì)FasL分子的表達(dá)有上調(diào)作用，與對(duì)照組比較差異有顯著性；Gs對(duì)Fas的表達(dá)亦有上調(diào)作用，而Ber無影響。結(jié)果提示，PG細(xì)胞有Fas

10、L、Fas分子的表達(dá)；Gs和Ber能促進(jìn)FasL和/或Fas的表達(dá)。 4.運(yùn)用ELISA法和放射性免疫法分別檢測PG細(xì)胞培養(yǎng)上清液中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和前列腺素E2(PGE2)的含量。結(jié)果顯示，PG細(xì)胞可分泌TGF-β1和PGE2，100μg/mlGs和5μg/ml、2.5μg/ml Ber均可以促進(jìn)TGF-β1的分泌；但Gs和Ber各濃度組均對(duì)PGE2的分泌無影響。結(jié)果提示，PG細(xì)胞能分泌TGF-β1和PGE2，