中國人群兒童孤獨(dú)癥的NRXN1基因關(guān)聯(lián)研究和兩種疾病相關(guān)拷貝數(shù)變異的鑒定.pdf

1、第一部分中國人群兒童孤獨(dú)癥的NRXN1基因關(guān)聯(lián)研究
　　 孤獨(dú)癥是一種嚴(yán)重影響兒童健康的神經(jīng)發(fā)育性障礙疾病,以社交相互性受損、語言和溝通障礙以及重復(fù)刻板行為為主要特征。孤獨(dú)癥是廣泛性發(fā)育障礙(PDD,Pervasive Developmental Disorder)的一個最重要的亞類。由于PDD以兒童孤獨(dú)癥為主,其他亞類也有類似的孤獨(dú)癥樣表現(xiàn),所以PDD又被稱為孤獨(dú)癥譜群疾病(ASD,Autism Spectrum Disord

2、er).孤獨(dú)癥的診斷缺乏客觀指標(biāo),主要以行為障礙為依據(jù)。孤獨(dú)癥缺乏特效治療,主要依賴行為學(xué)訓(xùn)練,其預(yù)后差,60-70%的患兒不能獨(dú)立生活。流行病學(xué)研究顯示,孤獨(dú)癥的發(fā)病率逐年上升,2012年3月美國疾病控制及預(yù)防中心(CDC)調(diào)查顯示的最新孤獨(dú)癥發(fā)病率已上升至11.3‰(1/88),其中男孩被診斷為孤獨(dú)癥的比例是1/54,是女孩的5倍。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計,中國有60-180萬的孤獨(dú)癥患兒,給社會造成極大的負(fù)擔(dān)。孤獨(dú)癥的病因復(fù)雜

3、,家系和雙生子研究結(jié)果表明遺傳因素在孤獨(dú)癥致病因素中起重要作用。研究結(jié)果表明,已鑒定的孤獨(dú)癥相關(guān)基因多數(shù)與突觸功能及神經(jīng)元可塑性相關(guān),如NRXN1,NLGN3和NLGN4, SHANK3,CNTNAP2,PCD9以及PCD10等。位于染色體2p16.3的NRXN1(neurexin-1)基因編碼neurexin蛋白,neurexin家族是一類高度多態(tài)性細(xì)胞表面蛋白,特異地表達(dá)于哺乳動物神經(jīng)元,參與細(xì)胞識別和細(xì)胞黏附,并可能介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)。α-neurexin或β-neurexin通過與neuroligin形成異四聚體,調(diào)控神經(jīng)元的突觸興奮或突觸抑制,而神經(jīng)突觸異?？赡軙?dǎo)致孤獨(dú)癥的發(fā)生。自2006年Friedman等首次報道NRXN-1α的新發(fā)雜合缺失與神經(jīng)發(fā)育疾病的相關(guān)性以來,在不同人群精神分裂癥、孤獨(dú)癥以及智力低下等多種精神疾病患者中均檢測到NRXN1基因外顯子的缺失突變。2008年,Kim等在孤獨(dú)癥患者中對NRXN1進(jìn)行重測序發(fā)現(xiàn)了罕見的錯義突變,提示NRXN

5、1與孤獨(dú)癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān).NRXN-1α缺失小鼠和果蠅模型的神經(jīng)行為學(xué)缺陷也為NRXN-1α參與孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)理提供了證據(jù)。這些研究結(jié)果顯示NRXN1是孤獨(dú)癥重要的候選易感基因之一。中國的孤獨(dú)癥研究明顯落后于國際前沿,中國漢族人群孤獨(dú)癥患者與NRXN1的相關(guān)性及突變篩查研究尚無報道,而不同種族的遺傳易感因素存在著很大的差別,因此,對中國漢族孤獨(dú)癥患者及其家系進(jìn)行NRXN1基因的突變篩查及相關(guān)性分析,有助于了解在中國漢族人群中,NRXN1

6、基因的變異與孤獨(dú)癥的關(guān)系。
　　 本研究利用直接測序法,在中國漢族人群313個孤獨(dú)癥患者中對NRXN-1α的所有編碼區(qū)外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)序列,NRXN-1β的1號外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)序列進(jìn)行了突變檢測。對于檢測到的帶有非同義突變的外顯子,在500個正常對照樣本中進(jìn)一步檢測,以驗證被檢突變是否為數(shù)據(jù)庫中未報道過的多態(tài)。對于檢測到所有非同義突變,尤其是僅在患者中出現(xiàn)而在對照中沒有出現(xiàn)的非同義變異,進(jìn)一步檢測其父母親

7、DNA樣本以證實該變異是父母遺傳還是新發(fā)(de novo)。在鑒定罕見或新發(fā)變異的同時,再進(jìn)行病例——對照(Case-Control)關(guān)聯(lián)研究。我們的研究共發(fā)現(xiàn)22個位于neurexin-1外顯子區(qū)域的變異,包括7個錯義突變,3個缺失和12個同義突變。在這些變異中,有3個錯義突變和3個同義突變是未報道過的新發(fā)突變且在500個正常對照中未檢出。另有4個錯義突變,3個缺失和3個同義突變在dbSNP數(shù)據(jù)庫中末報道過,同時在500個正常對照中有

8、檢出。此外,我們的結(jié)果中還包含了2個編碼區(qū)和4個內(nèi)含子區(qū)的已知SNPs。對所有患者和對照中均檢測到的變異的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明,SNP (rs2303298)的等位基因頻率和基因型頻率在患者組和對照組之間的有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(26.2%vs.13.8%；χ2=22.487；p=3.45E-006；OR=2.152(1.559-2.970))。
　　 本研究結(jié)果顯示NRXN1基因的一個常見SNP (rs2303298)與中國漢族人群孤

9、獨(dú)癥的發(fā)生顯著相關(guān)。在更多樣本中發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥相關(guān)的NRXN1基因變異,并開展其分子致病機(jī)制的研究,有望闡明NRXN1在孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 第二部分兩種孤獨(dú)癥相關(guān)拷貝數(shù)變異的鑒定
　　 已有的研究顯示,染色體異常及罕見基因變異等與孤獨(dú)癥的發(fā)生有關(guān),隨著基因組學(xué)研究的發(fā)展,拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations, CNVs)也被認(rèn)為與孤獨(dú)癥的發(fā)生有關(guān),基于高密度芯片的拷貝數(shù)變異研究使孤獨(dú)癥易感位點(diǎn)

10、的鑒定取得了很大的進(jìn)展。孤獨(dú)癥是最早開展CNVs全基因組關(guān)聯(lián)分析研究的疾病之一。2007年Sebat等最早報道了孤獨(dú)癥與新發(fā)CNVs顯著相關(guān),隨后有研究小組在孤獨(dú)癥家系中發(fā)現(xiàn)16p11.2新發(fā)的約593kb的缺失,此研究結(jié)果得到了其他三個研究小組的驗證。研究發(fā)現(xiàn)的孤獨(dú)癥相關(guān)CNVs區(qū)域包含了許多新的孤獨(dú)癥相關(guān)基因,例如SHANK2,SYNGAP1, DLGAP2以及X染色體連鎖DDX53-PTCHD1位點(diǎn)等。到目前為止,已有研究顯示約7

11、%-20%的孤獨(dú)癥患者存在疾病相關(guān)的CNVs,涉及染色體主要包括1、3、5、7、15、16和22等。這些研究為拷貝數(shù)變異參與孤獨(dú)癥等遺傳異質(zhì)性很強(qiáng)的復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)理提供了重要證據(jù)。而所有這些已發(fā)現(xiàn)的CNVs在不同的患者身上可能影響不同的基因,這意味著盡管不同的孤獨(dú)癥患者擁有相似癥狀,但引起癥狀的原因卻可能是不同的遺傳缺陷。因此,鑒定新的CNVs位點(diǎn)將為定位CNVs累及的可能易感基因提供研究基礎(chǔ)。
　　 為了闡明中國漢族人群的孤

12、獨(dú)癥遺傳基礎(chǔ),本研究采用HumanCNV370-Duo芯片對455例孤獨(dú)癥患者樣本進(jìn)行全基因組基因分型,并用軟件cnv Partition v2.4.4對患者和對照樣本的分型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組CNVs分析。對得到的CNVs結(jié)果與正常對照、Database of Genomic Variants(DGV)數(shù)據(jù)庫等比較,分類已報道的CNVs和我們新發(fā)現(xiàn)的罕見CNVs.對新發(fā)罕見CNVs利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)進(jìn)

13、行驗證。進(jìn)一步地利用生物信息學(xué)分析方法對這些罕見CNVs區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行篩選,評價該位點(diǎn)與孤獨(dú)癥的相關(guān)性以及對發(fā)病風(fēng)險的貢獻(xiàn)。孤獨(dú)癥是一種與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的疾病,遺傳學(xué)因素導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì)、酶、受體、神經(jīng)遞質(zhì)等的異常表達(dá),引起神經(jīng)元增殖和分化異常,提供了孤獨(dú)癥易感性的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此,在進(jìn)行生物信息學(xué)分析時重點(diǎn)關(guān)注相關(guān)CNVs中與神經(jīng)發(fā)生和發(fā)育有關(guān)的基因。
　　 本研究在455例孤獨(dú)癥患者中發(fā)現(xiàn)了大量CNVs,通過與正常對

14、照CNVs進(jìn)行病例——對照(Case-Control)分析以及與DGV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比,我們在兩個孤獨(dú)癥患者中分別發(fā)現(xiàn)了兩個新發(fā)的罕見CNVs。其一是位于5號染色體5p15.33-p15.2區(qū)域的一個8MB的雜合缺失,屬于拷貝數(shù)減少改變,為新發(fā)CNV,該區(qū)域內(nèi)的SLC6A3基因被報道參與多種與神經(jīng)發(fā)育異常有關(guān)的精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生；其二是位于10號染色體10p12.33區(qū)域的一個1MB的雜合重復(fù),屬于拷貝數(shù)增加改變,該區(qū)域內(nèi)的CACN

15、B2基因?qū)儆阝}離子通道基因,已有研究表明異常的鈣離子信號通道可能導(dǎo)致孤獨(dú)癥相關(guān)表型。此外,該區(qū)域內(nèi)的PTPLA和STAM基因參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo),被認(rèn)為與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。這些基因可能影響神經(jīng)發(fā)生或發(fā)育有關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá),提示這兩個新發(fā)CNVs可能與孤獨(dú)癥發(fā)生相關(guān)。本研究在455例孤獨(dú)癥患者中鑒定了兩種新的孤獨(dú)癥相關(guān)CNVs位點(diǎn),這兩個CNVs所包含的基因?qū)⒊蔀槲覀兘酉聛淼闹攸c(diǎn)研究的對象。本研究為孤獨(dú)癥易感基因的定位和克隆研究提供了一定分子研究