中國人群兒童孤獨癥的NRXN1基因關聯(lián)研究和兩種疾病相關拷貝數(shù)變異的鑒定.pdf

1、第一部分中國人群兒童孤獨癥的NRXN1基因關聯(lián)研究
　　 孤獨癥是一種嚴重影響兒童健康的神經(jīng)發(fā)育性障礙疾病,以社交相互性受損、語言和溝通障礙以及重復刻板行為為主要特征。孤獨癥是廣泛性發(fā)育障礙(PDD,Pervasive Developmental Disorder)的一個最重要的亞類。由于PDD以兒童孤獨癥為主,其他亞類也有類似的孤獨癥樣表現(xiàn),所以PDD又被稱為孤獨癥譜群疾病(ASD,Autism Spectrum Disord

2、er).孤獨癥的診斷缺乏客觀指標,主要以行為障礙為依據(jù)。孤獨癥缺乏特效治療,主要依賴行為學訓練,其預后差,60-70%的患兒不能獨立生活。流行病學研究顯示,孤獨癥的發(fā)病率逐年上升,2012年3月美國疾病控制及預防中心(CDC)調(diào)查顯示的最新孤獨癥發(fā)病率已上升至11.3‰(1/88),其中男孩被診斷為孤獨癥的比例是1/54,是女孩的5倍。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計,中國有60-180萬的孤獨癥患兒,給社會造成極大的負擔。孤獨癥的病因復雜

3、,家系和雙生子研究結果表明遺傳因素在孤獨癥致病因素中起重要作用。研究結果表明,已鑒定的孤獨癥相關基因多數(shù)與突觸功能及神經(jīng)元可塑性相關,如NRXN1,NLGN3和NLGN4, SHANK3,CNTNAP2,PCD9以及PCD10等。位于染色體2p16.3的NRXN1(neurexin-1)基因編碼neurexin蛋白,neurexin家族是一類高度多態(tài)性細胞表面蛋白,特異地表達于哺乳動物神經(jīng)元,參與細胞識別和細胞黏附,并可能介導細胞信號轉(zhuǎn)

4、導。α-neurexin或β-neurexin通過與neuroligin形成異四聚體,調(diào)控神經(jīng)元的突觸興奮或突觸抑制,而神經(jīng)突觸異?？赡軙е鹿陋毎Y的發(fā)生。自2006年Friedman等首次報道NRXN-1α的新發(fā)雜合缺失與神經(jīng)發(fā)育疾病的相關性以來,在不同人群精神分裂癥、孤獨癥以及智力低下等多種精神疾病患者中均檢測到NRXN1基因外顯子的缺失突變。2008年,Kim等在孤獨癥患者中對NRXN1進行重測序發(fā)現(xiàn)了罕見的錯義突變,提示NRXN

5、1與孤獨癥的發(fā)生和發(fā)展有關.NRXN-1α缺失小鼠和果蠅模型的神經(jīng)行為學缺陷也為NRXN-1α參與孤獨癥發(fā)病機理提供了證據(jù)。這些研究結果顯示NRXN1是孤獨癥重要的候選易感基因之一。中國的孤獨癥研究明顯落后于國際前沿,中國漢族人群孤獨癥患者與NRXN1的相關性及突變篩查研究尚無報道,而不同種族的遺傳易感因素存在著很大的差別,因此,對中國漢族孤獨癥患者及其家系進行NRXN1基因的突變篩查及相關性分析,有助于了解在中國漢族人群中,NRXN1

6、基因的變異與孤獨癥的關系。
　　 本研究利用直接測序法,在中國漢族人群313個孤獨癥患者中對NRXN-1α的所有編碼區(qū)外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)序列,NRXN-1β的1號外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)序列進行了突變檢測。對于檢測到的帶有非同義突變的外顯子,在500個正常對照樣本中進一步檢測,以驗證被檢突變是否為數(shù)據(jù)庫中未報道過的多態(tài)。對于檢測到所有非同義突變,尤其是僅在患者中出現(xiàn)而在對照中沒有出現(xiàn)的非同義變異,進一步檢測其父母親

7、DNA樣本以證實該變異是父母遺傳還是新發(fā)(de novo)。在鑒定罕見或新發(fā)變異的同時,再進行病例——對照(Case-Control)關聯(lián)研究。我們的研究共發(fā)現(xiàn)22個位于neurexin-1外顯子區(qū)域的變異,包括7個錯義突變,3個缺失和12個同義突變。在這些變異中,有3個錯義突變和3個同義突變是未報道過的新發(fā)突變且在500個正常對照中未檢出。另有4個錯義突變,3個缺失和3個同義突變在dbSNP數(shù)據(jù)庫中末報道過,同時在500個正常對照中有

8、檢出。此外,我們的結果中還包含了2個編碼區(qū)和4個內(nèi)含子區(qū)的已知SNPs。對所有患者和對照中均檢測到的變異的統(tǒng)計學分析結果表明,SNP (rs2303298)的等位基因頻率和基因型頻率在患者組和對照組之間的有顯著統(tǒng)計學差異(26.2%vs.13.8%；χ2=22.487；p=3.45E-006；OR=2.152(1.559-2.970))。
　　 本研究結果顯示NRXN1基因的一個常見SNP (rs2303298)與中國漢族人群孤

9、獨癥的發(fā)生顯著相關。在更多樣本中發(fā)現(xiàn)孤獨癥相關的NRXN1基因變異,并開展其分子致病機制的研究,有望闡明NRXN1在孤獨癥發(fā)病機制中的作用。
　　 第二部分兩種孤獨癥相關拷貝數(shù)變異的鑒定
　　 已有的研究顯示,染色體異常及罕見基因變異等與孤獨癥的發(fā)生有關,隨著基因組學研究的發(fā)展,拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations, CNVs)也被認為與孤獨癥的發(fā)生有關,基于高密度芯片的拷貝數(shù)變異研究使孤獨癥易感位點

10、的鑒定取得了很大的進展。孤獨癥是最早開展CNVs全基因組關聯(lián)分析研究的疾病之一。2007年Sebat等最早報道了孤獨癥與新發(fā)CNVs顯著相關,隨后有研究小組在孤獨癥家系中發(fā)現(xiàn)16p11.2新發(fā)的約593kb的缺失,此研究結果得到了其他三個研究小組的驗證。研究發(fā)現(xiàn)的孤獨癥相關CNVs區(qū)域包含了許多新的孤獨癥相關基因,例如SHANK2,SYNGAP1, DLGAP2以及X染色體連鎖DDX53-PTCHD1位點等。到目前為止,已有研究顯示約7

11、%-20%的孤獨癥患者存在疾病相關的CNVs,涉及染色體主要包括1、3、5、7、15、16和22等。這些研究為拷貝數(shù)變異參與孤獨癥等遺傳異質(zhì)性很強的復雜疾病的發(fā)病機理提供了重要證據(jù)。而所有這些已發(fā)現(xiàn)的CNVs在不同的患者身上可能影響不同的基因,這意味著盡管不同的孤獨癥患者擁有相似癥狀,但引起癥狀的原因卻可能是不同的遺傳缺陷。因此,鑒定新的CNVs位點將為定位CNVs累及的可能易感基因提供研究基礎。
　　 為了闡明中國漢族人群的孤

12、獨癥遺傳基礎,本研究采用HumanCNV370-Duo芯片對455例孤獨癥患者樣本進行全基因組基因分型,并用軟件cnv Partition v2.4.4對患者和對照樣本的分型數(shù)據(jù)進行全基因組CNVs分析。對得到的CNVs結果與正常對照、Database of Genomic Variants(DGV)數(shù)據(jù)庫等比較,分類已報道的CNVs和我們新發(fā)現(xiàn)的罕見CNVs.對新發(fā)罕見CNVs利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術進

13、行驗證。進一步地利用生物信息學分析方法對這些罕見CNVs區(qū)域內(nèi)的基因進行篩選,評價該位點與孤獨癥的相關性以及對發(fā)病風險的貢獻。孤獨癥是一種與神經(jīng)發(fā)育有關的疾病,遺傳學因素導致神經(jīng)發(fā)育有關的蛋白質(zhì)、酶、受體、神經(jīng)遞質(zhì)等的異常表達,引起神經(jīng)元增殖和分化異常,提供了孤獨癥易感性的生物學基礎。因此,在進行生物信息學分析時重點關注相關CNVs中與神經(jīng)發(fā)生和發(fā)育有關的基因。
　　 本研究在455例孤獨癥患者中發(fā)現(xiàn)了大量CNVs,通過與正常對

14、照CNVs進行病例——對照(Case-Control)分析以及與DGV數(shù)據(jù)庫進行對比,我們在兩個孤獨癥患者中分別發(fā)現(xiàn)了兩個新發(fā)的罕見CNVs。其一是位于5號染色體5p15.33-p15.2區(qū)域的一個8MB的雜合缺失,屬于拷貝數(shù)減少改變,為新發(fā)CNV,該區(qū)域內(nèi)的SLC6A3基因被報道參與多種與神經(jīng)發(fā)育異常有關的精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生；其二是位于10號染色體10p12.33區(qū)域的一個1MB的雜合重復,屬于拷貝數(shù)增加改變,該區(qū)域內(nèi)的CACN

15、B2基因?qū)儆阝}離子通道基因,已有研究表明異常的鈣離子信號通道可能導致孤獨癥相關表型。此外,該區(qū)域內(nèi)的PTPLA和STAM基因參與信號轉(zhuǎn)導,被認為與神經(jīng)退行性疾病相關。這些基因可能影響神經(jīng)發(fā)生或發(fā)育有關蛋白質(zhì)的表達,提示這兩個新發(fā)CNVs可能與孤獨癥發(fā)生相關。本研究在455例孤獨癥患者中鑒定了兩種新的孤獨癥相關CNVs位點,這兩個CNVs所包含的基因?qū)⒊蔀槲覀兘酉聛淼闹攸c研究的對象。本研究為孤獨癥易感基因的定位和克隆研究提供了一定分子研究